Die Gentechnik oder auch Gentechnologie sind ein Anwendungsbereich der Genetik. Methoden der Gentechnik haben das Ziel, Erbgut zu untersuchen, zu vervielfältigen oder zu verändern. Die Herstellung von rekombinanter DNA ist ein Teilprozess zur Veränderung von Erbgut.
Rekombinante DNA – Definition
In der Gentechnik wird Erbgut (DNA) verändert. Genetisches Material (DNA beziehungsweise Gene) wird neu angeordnet und verknüpft (rekombiniert). Wie rekombinante DNA definiert ist, welche unterschiedlichen Werkzeuge benötigt werden, um diese herzustellen und wofür diese Methode angewendet werden kann, kannst Du Dir in dem folgenden Abschnitt aneignen.
Unter rekombinanter DNA versteht man ein künstliches DNA-Fragment, welches mithilfe von gentechnischen Methoden im Labor (in vitro) hergestellt wurde. Hierfür wird genetisches Material (etwa ein Gen) aus einem Spenderorganismus isoliert und mit anderem genetischem Material verknüpft. Durch die Neuanordnung (Rekombination) wird die genetische Information verändert.
Rekombinante DNA – Technologie
Wie in den meisten gentechnologischen Methoden werden zur Herstellung von rekombinanter DNA unterschiedliche gentechnische Werkzeuge benötigt. Bei diesen gentechnologischen Werkzeugen handelt es sich meistens um unterschiedliche Enzyme, welche bestimmte Reaktionen begünstigen.
Enzyme sind Proteine, welche in den Zellen von Organismen an einer Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen beteiligt sind. Hierbei dienen sie als Biokatalysatoren. Biokatalysatoren ermöglichen, dass Reaktionen schneller ablaufen und stattfinden können.
Rekombinante DNA – Benötigte Enzyme
Rekombinante DNA – Weitere Werkzeuge
Vektoren: Vektoren dienen als Transportmittel für Nukleinsäuren (DNA-Fragmente). In der Gentechnik werden Vektoren genutzt, um rekombinante DNA in eine Wirtszelle beziehungsweise in einen Organismus zu integrieren. Ein typischer Vektor sind Plasmide. Plasmidvektoren sind kleine ringförmige DNA-Fragmente, welche aus Bakterien isoliert werden.
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Rekombinante DNA – Anwendung & Beispiel
Die Herstellung von rekombinanter DNA ist Teil von vielen gentechnischen Standardverfahren. Diese Technik spielt eine bedeutende Rolle in der genetischen Grundlagenforschung, sowie in industriell relevanten und biotechnologischen Verfahren.
Nach der Herstellung von rekombinanter DNA wird diese in eine Wirtszelle oder Wirtsorganismus integriert. Es entsteht ein transgener Organismus.
Durch die Integrierung ausgewählter Gene in Bakterienzellen können gewünschte Proteine durch Bakterien hergestellt werden. In der Pflanzen- und Tierzucht versucht man genetisch modifizierte Individuen (transgene Organismen) hervorzubringen, welche eine stärkere Ausprägung gewünschter Merkmale aufweisen.
Transgene Organismen sind Lebewesen, in denen fremdes genetisches Material (DNA / Erbgut) integriert wurde. Das integrierte genetische Material kann von einer anderen Art stammen.
Herstellung von Humaninsulin
Diabetiker sind auf die Zuführung von Insulin angewiesen. Früher wurde Patienten Insulin von Schweinen verabreicht, welches für den Menschen nicht immer gut verträglich ist. Seit 1980 ist es möglich, mithilfe von gentechnischen Verfahren, Humaninsulin zu produzieren.
Zur Herstellung von Humaninsulin wird das Gen aus einer menschlichen Zelle isoliert. Anschließend wird das Gen in einen Plasmidvektor integriert. Hierbei wird das Gen mit der Vektor-DNA neu verknüpft, wodurch rekombinante DNA entsteht.
Die rekombinante DNA, in Form eines Plasmidrings, wird im nächsten Schritt in eine geeignete Bakterienzelle integriert. Wurde die rekombinante DNA erfolgreich integriert, kann die entsprechende Bakterienzelle vermehrt werden.
In den Bakterienzellen wird das Gen durch die Proteinbiosynthese in das Protein Humaninsulin umgesetzt. Zuletzt wird das Protein aus den Bakterien isoliert und kann zu einem Medikament verarbeitet werden. Proteine, die auf diese Weise produziert werden, bezeichnet man als rekombinante Proteine.
Rekombinante Proteine sind Proteine, welche biotechnologisch, mithilfe von genetisch modifizierten Organismen, hergestellt wurden. Rekombinante Proteine entstehen, wenn rekombinante DNA in Proteine umgesetzt werden (durch die Proteinbiosynthese der transgenen Wirtsorganismen).
Rekombinante DNA – Herstellung
Zur Herstellung rekombinanter DNA werden verschiedene Schritte in einer bestimmten Reihenfolge durchgeführt. Dabei kommen die genannten gentechnischen Werkzeuge zum Einsatz. Im folgenden Abschnitt wird auf die einzelnen Schritte der Methode eingegangen.
1. Isolierung der DNA
Zur Isolierung von DNA wird die Membran und der Zellkern der Spenderzelle aufgelöst. Anschließend werden die enthaltenen Proteine durch Enzyme (Proteasen) abgebaut. Mithilfe von Ethanol kann die DNA von der Lösung separiert werden. Durch Restriktionsenzyme wird die DNA in Fragmente geschnitten, welche geeignet sind, um sie in einen Vektor zu integrieren.
2. Isolierung und Aufschneiden des Vektors
Häufig werden Plasmide aus Bakterien (Plasmidvektoren) isoliert, oder modifizierte Virus-Partikel als Vektoren genutzt. Diese werden isoliert und entsprechend modifiziert, um als Vektor funktionieren zu können. Im nächsten Schritt wird die Vektor-DNA an einer spezifischen Stelle geschnitten. Es entsteht eine Lücke, in welcher die Spender-DNA integriert werden kann.
Wichtig ist, dass beim Schneiden der Spender-DNA und der Vektor-DNA dieselben Restriktionsenzyme genutzt werden. Dadurch sind die Enden der Fragmente komplementär zueinander und können wieder miteinander verknüpft werden.
3. Hybridisierung
Die Hybridisierung ist der Schritt der Rekombination der DNA. Die Spender-DNA wird mit der Vektor-DNA, mithilfe von Ligasen, verknüpft. Als Produkt erhält man rekombinante DNA (Abbildung 1).
Wird die Spender-DNA in einen Plasmidvektor integriert, spricht man nach der Verknüpfung von einem Hybridplasmid.
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4. Integrierung in eine Wirtszelle
Im nächsten Schritt wird die rekombinante DNA in eine Wirtszelle eingeschleust. Hierbei handelt es sich um einen sogenannten Gentransfer. Je nachdem welcher Vektor genutzt wurde und in welchen Organismus die rekombinante DNA integriert werden soll, wurden unterschiedliche Verfahren zur Integrierung entwickelt.
Plasmidvektoren werden durch Transformation in die Wirtszelle integriert. Hierfür wird die Wirtszelle (Bakterien- oder Tierzelle), zum Beispiel Calciumionen, mit kurzen elektronischen Impulsen behandelt. Durch diese Behandlung wird die Membran für die Vektoren durchlässig gemacht. Die Plasmidvektoren können über die Zellmembran in die Wirtszelle integriert werden.
Bei einem Gentransfer mittels Plasmidvektoren spricht man von einer Transformation. Eine Transformation ist die Integration von Fremd-DNA in einen Organismus, ohne die Hilfe von Viren oder einer Spenderzelle.
Als Gentransfer wird das Einbringen oder Übertragen von genetischem Material (DNA oder RNA) in eine Wirtszelle bezeichnet. Durch den Gentransfer können Organismen gentechnisch modifiziert werden.
5. Selektive Identifizierung
Die Methode zur Herstellung von rekombinanter DNA und deren einzelne Teilschritte haben keine 100%ige Erfolgsquote. Am Beispiel der Plasmidvektoren hat das zur Folge, dass bei der Hybridisierung, die Spender-DNA nur von einem Teil der Plasmidvektoren integriert wird. Im Teilschritt der Transformation nimmt nur ein geringer Teil der Bakterienzellen ein Plasmid in sich auf.
Daher müssen die Wirtszellen, in denen die Spender-DNA erfolgreich integriert wurde, von den anderen unterschieden werden. Hierfür werden Eigenschaften genutzt, welche den Wirtszellen durch die integrierten Vektoren verliehen werden.
Am folgenden Beispiel kannst Du Dir ein Bild davon machen, wie ein Selektionsverfahren, zur Identifizierung von erfolgreich integrierter rekombinanter DNA, aussehen kann.
Hybridvektor Klonselektion (Abblidung 2)
Plasmidvektoren beinhalten häufig zwei Antibiotika-Resistenzgene (z.B für Ampicillin und Tetracyclin), welche für entsprechende Selektionsverfahren genutzt werden.
Plasmidvektoren, in denen die Spender-DNA erfolgreich integriert wurde (Hybridplasmid), besitzen nur noch ein Antibiotika-Resistenzgen. Das ist der Fall, da die Spender-DNA anstelle eines der Resistenzgene eingefügt wird. Plasmide, in denen der Einbau der DNA gescheitert ist, verleihen Bakterien Resistenzen gegenüber beiden Antibiotika-Arten.
Die Bakterien werden jetzt auf zwei unterschiedlichen Nährböden zu Bakterienkolonien kultiviert. Einer der Nährböden beinhaltet das Antibiotikum (Beispiel: Ampicillin) gegen welches beide Bakterienarten resistent sind. Der andere Nährboden beinhaltet beide Arten Antibiotika (Beispiel: Ampicillin und Tetracyclin).
Auf dem Nährboden mit dem Ampicillin wachsen alle Bakterien, die erfolgreich einen Plasmidvektor in sich aufgenommen haben. Auf dem Nährboden mit Ampicillin und Tetracyclin wachsen nur die Bakterien, die einen Plasmidvektor ohne Fremd-DNA aufgenommen haben.
Da die Bakterien durch die sogenannte Stempeltechnik von einem Nährboden auf den anderen Nährboden übertragen wurden (die Bakterien sind dadurch identisch angeordnet), können im Anschluss die Bakterien selektiert werden, welche Hybridvektoren mit der integrierten Fremd-DNA aufgenommen haben.
Im Anschluss werden diese Bakterien dann vermehrt. Die Nachkommen besitzen die identische DNA und somit auch das integrierte DNA-Fragment.
6. Vermehrung der transgenen Organismen
Sind die Zellen mit der integrierten DNA identifiziert, werden diese im nächsten Schritt vermehrt. Bei der Vermehrung der Zellen spricht man von einer sogenannten Klonierung. Durch die Replikationsenzyme der Wirtszelle (DNA-Polymerasen) wird der Vektor samt der integrierten DNA vervielfacht. Somit kann diese an die nächste Zellgeneration weitergegeben werden. Es entsteht eine Zellkolonie mit identischem Erbgut.
Als Klonierung wird die Herstellung identischer Zellen mit gleichem Erbgut bezeichnet (Klone), aber auch die Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Fragments (DNA-Klonierung).
Rekombinante DNA - Das Wichtigste auf einen Blick
- Rekombinante DNA entsteht, wenn genetisches Material (DNA beziehungsweise Gene) isoliert und mit anderer DNA neu verknüpft und angeordnet wird (rekombiniert).
- Zur Herstellung rekombinanter DNA werden Ligasen, Restriktionsenzyme, Polymerasen und Vektoren benötigt.
- Nach der Isolation von Vektor- und Spender-DNA werden diese mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten.
- Bei der Hybridisierung werden Vektor- und Spender-DNA durch Ligasen zur rekombinanten DNA verknüpft.
- Via Gentransfer wird die rekombinante DNA in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust.
- Mithilfe von Selektionsverfahren werden transgene Wirtszellen von anderen unterschieden.
- Rekombinante DNA wird in der Biotechnologie verwendet, um mithilfe von Bakterien rekombinante Proteine herzustellen (Beispiel: Insulin).
- In der Tier- und Pflanzenzucht wird rekombinante DNA verwendet, um Organismen gentechnologisch zu optimieren.
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