Der Ablauf der DNA Replikation erscheint Dir heute vielleicht nur als pures Auswendiglernen. Der Doppelstrang wird aufgespalten, es werden Primer angesetzt und dann wird auch schon der komplementäre Tochterstrang synthetisiert. Das alles erscheint Dir logisch und es bleiben meist keine Fragen offen.
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Noch vor wenigen Jahrzehnten hingegen wusste man vergleichsweise wenig über die genauen Abläufe der DNA Replikation. Es gab drei Theorien, die zur Diskussion standen, aber erst mit dem Experiment von Matthew Meselson und Franklin William Stahl im Jahr 1958 konnte bewiesen werden, dass es sich bei der DNA Replikation um einen semikonservativen Mechanismus handelt.
Meselson Stahl Experiment – Erklärung
Das genetische Material der Elterngeneration wird bei der Vererbung an die nächste Generation weiter gegeben. Dazu muss die DNA zuerst über die DNA Replikation verdoppelt werden.
Es gab drei Theorien zum genauen Ablauf der DNA Replikation:
- Konservative Replikation: Hier bleibt die Eltern-DNA vollständig erhalten. Es werden einzelne Kopien beider Stränge erstellt, welche sich dann zu einem Doppelstrang zusammensetzen.
- Semikonservative Replikation: Die Eltern-DNA wird in Einzelstränge aufgespalten und es wird je ein komplementärer Tochterstrang ergänzt.
- Dispersive Replikation: Dieser Mechanismus ist ähnlich der semikonservativen Replikation. Jede Tochter-DNA besteht zur Hälfte aus der Eltern-DNA. Hier wird jedoch nicht ein neuer ununterbrochener komplementärer Strang erzeugt, sondern die Nucleotide der Eltern-DNA wechseln sich mit den neu ergänzten Nucleotiden ab.
Die Bezeichnungen kannst Du Dir leicht merken! Konservativ bedeutet "erhaltend", bei der konservativen Replikation bleibt also der vollständige Eltern-Doppelstrang erhalten, während bei der semikonservativen Replikation nur die Hälfte, also die Einzelstränge vollständig erhalten bleiben. Dispersiv leitet sich vom lateinischen Begriff "disperge" ab und bedeutet so viel wie "ausbreiten" oder "zerstreuen". So kannst Du Dir die DNA Replikation nach dem dispersiven Mechanismus auch in etwa vorstellen.
Meselson Stahl Experiment – Ablauf
Das Ziel von Meselson und Stahl war es, mit dem Experiment zu beweisen, dass es sich bei der DNA Replikation um den semikonservativen Mechanismus handelt.
James D. Watson und Francis C. Crick, die Entdecker der Doppel-Helix-Struktur der DNA, vermuteten bereits, dass die DNA Replikation dem semikonservativen Mechanismus folgen könnte.
Meselson Stahl Experiment – Vorbereitungen
Für ihr Experiment verwendeten Meselson und Stahl Escherichia coli Bakterien, welche vorerst auf einem Nährmedium mit dem Stickstoffisotop 15 N kultiviert wurden.
Isotope sind Atome eines Elements mit gleicher Ordnungszahl, aber unterschiedlicher Massenzahl. Sie haben die gleiche Anzahl an Protonen, aber eine unterschiedliche Anzahl Neutronen, wodurch ihre Masse variiert.
Ein Großteil des Stickstoffs, welches natürlich vorkommt, ist 14 N Stickstoff (über 99 %). 15 N Stickstoffatome sind zwar stabil, kommen aber unter natürlichen Bedingungen weitestgehend nicht vor. Beide Stickstoffisotope unterscheiden sich, wie Du bereits gelernt hast, in ihrer Masse. Das 15 N Stickstoffisotop ist schwerer als das 14 N und genau diese Eigenschaft machten sich Meselson und Stahl in ihrem Experiment zunutze.
Durch die Kultivierung auf einem Nährmedium mit 15 N kam es zum Einbau des Stickstoffisotops in die DNA der Bakterien. Nach einigen Generationen enthielt ihr Erbgut nur noch das Isotop 15 N und es war kein 14 N mehr zu finden. Somit waren diese Bakterien deutlich schwerer als andere E. coli Bakterien, welche sich nicht in diesem speziellen Nährmedium vermehrt hatten.
Meselson Stahl Experiment – Durchführung
Am Anfang des Experiments liegt eine Generation E. coli Bakterien vor, dessen Erbgut das Stickstoffisotop 15 N enthalten.
E. coli Bakterien können sich unter idealen Bedingungen, wie sie beispielsweise in einem angesetzten Nährboden im Labor gegeben sind, in innerhalb von 20 Minuten teilen. Daher entsteht etwa alle 20 Minuten eine neue Generation.
Die Bakterien mit dem eingebauten 15 N werden jetzt auf einen anderen Nährboden gesetzt, welcher ausschließlich das typische Stickstoffisotop 14 N enthält. Teilen sich die Bakterien nun und replizieren in diesem Zusammenhang zuvor ihre DNA, so muss das Stickstoffisotop 14 N dafür verwendet werden.
Nach 20 Minuten entnahmen Meselson und Stahl die erste Probe. Dabei handelte es sich um die erste Generation, welche bereits das Stickstoffisotop 14 N in ihrem Erbgut eingebaut haben muss. Dieser Vorgang wurde weitere zwei Male wiederholt. Dementsprechend fanden in dieser Zeit zwei weitere Teilungen statt, bei denen wieder das Isotop 14 N eingebaut wurde. Der 15N-Anteil sinkt dabei also kontinuierlich.
Meselson Stahl Experiment – Ergebnis
Um das Experiment auszuwerten, bedienten sich Meselson und Stahl an der sogenannten Dichtegradientenzentrifugation. Dadurch werden DNA-Moleküle nach ihrem Gewicht geordnet. Die DNA der Bakterien aus den verschiedenen Proben wurde extrahiert und anschließend zentrifugiert.
Auf der Abbildung kannst Du verschiedene Banden erkennen, welche die Bakterien-DNA nach ihrem Gewicht geordnet darstellen. Die erste entnommene Probe stammt noch aus dem 15 N-haltigem Nährboden, somit ist hier kein 14 N enthalten. Da 15 N schwerer als 14 N ist, befindet sich diese Bande am Boden des Reagenzglases.
Ausschluss der konservativen Replikation
In der zweiten Probe befindet sich lediglich DNA, welche sowohl 14 N als auch 15 N enthält, da die Bande etwa in der Mitte liegt.
Wenn es sich bei der DNA Replikation um den konservativen Mechanismus handeln würde, so würde 50 % der entnommenen DNA-Moleküle lediglich aus 15 N Isotopen und die anderen 50 % aus 14 N bestehen. Dabei würden zwei Banden entstehen – eine Bande am Boden und eine Bande am oberen Rand des Reagenzglases.
Hier liegt jedoch nur eine Bande in der Mitte vor, weshalb die DNA-Moleküle sowohl aus dem 14 N als auch aus dem 15 N Isotopen bestehen. Daher kann der konservative Mechanismus ausgeschlossen werden.
Es wurden also bei der ersten Replikation im 14 N-haltigem Medium Teile der Elternstränge mit 15 N Isotopen erhalten und neue komplementäre Stränge mit 14 N Isotopen synthetisiert.
Ausschluss der dispersiven Replikation
Mithilfe der dritten Probe konnte auch die dispersive Replikation widerlegt werden. Hier bildet sich eine Bande im Bereich 14 N und eine im Bereich 15 N / 14 N.
Würde die DNA Replikation dispersiv ablaufen, würde jedes DNA-Molekül nach wie vor geringe Mengen an 15 N Isotopen aufweisen. Da jedoch eine Bande am oberen Rand des Glases zu erkennen ist, enthält diese Probe auch DNA, welche ausschließlich aus den leichten 14 N Isotopen aufgebaut ist. Diese können nur entstehen, wenn die DNA Replikation dem semikonservativen Mechanismus folgt.
So kamen Meselson und Stahl zu dem Ergebnis, dass die DNA Replikation nach dem semikonservativen Mechanismus abläuft und bestätigten Watson und Cricks Theorie.
Meselson Stahl Experiment – Das Wichtigste
- Das Meselson und Stahl Experiment beweist, dass es sich bei der DNA Replikation um den semikonservativen Mechanismus handelt. Der konservative und dispersive Mechanismus werden dabei widerlegt.
- Semikonservative Replikation bedeutet, dass die Eltern-DNA in Einzelstränge aufgespalten und je ein komplementärer Tochterstrang ergänzt wird. Daher wird der semikonservative Mechanismus auch als halberhaltend bezeichnet.
- Für das Experiment wurden E. coli Bakterien mit unterschiedlich schweren Stickstoffisotopen ernährt, welche sie in ihr Erbgut einbauten.
- Die Stickstoffisotope 14 N und 15 N unterscheiden sich chemisch nicht voneinander, ihr einziger Unterschied liegt in ihrer Masse, der durch die unterschiedliche Anzahl von Neutronen zustande kommt.
- Durch die unterschiedliche Verteilung der Banden nach einer Dichtegradientenzentrifugation konnte bewiesen werden, dass die Replikation der DNA semikonservativ abläuft.
Nachweise
- Meselson and Stahl (1958) The Replication of DNA in Escherichia coli, PNAS
- Frederic L. Holmes (2001) Meselson, Stahl and the Replication of DNA: A history of the most beautiful experiment in biology, Yale University Press
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