Homologe Rekombination

Das wichtigste Gut in Zellen ist wohl die DNA. Die Erbinformation, die sie codiert, hält einen Organismus nicht nur am Leben, sondern sichert auch das Fortbestehen nachfolgender Generationen. Umso gravierender ist es, wenn die DNA beschädigt wird. Daher haben Zellen im Laufe der Evolution Reparaturmechanismen entwickelt, die sie für die Instandhaltung der DNA und daher zur Überlebenssicherung der betroffenen Organismen benötigen. Eines dieser Mechanismen ist die homologe Rekombination.

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsangabe

    Bei der homologen Rekombination kann eine Lücke in einem DNA-Strang geschlossen werden, indem ein identischer DNA-Abschnitt eines anderen Chromosoms genutzt wird, um die entfernte Stelle neu zusammenzubauen.

    Homologen Rekombination – Ablauf

    Die homologe Rekombination setzt voraus, dass zwei identische oder ähnliche doppelsträngige DNA-Moleküle in unmittelbarer Nähe zueinander liegen. Dabei muss nicht der ganze Strang identisch sein. Es reicht schon, wenn eine längere homologe (identische) Sequenz vorliegt.

    Eine Auffrischung zum Aufbau der DNA findest Du in den StudySmarter-Artikeln zum Chromosom, dem DNA Aufbau und Nukleinbasen.

    Kürzung der Enden nach Doppelstrangbruch

    Bevor die Rekombination starten kann, müssen die Enden des kaputten Stranges zunächst auf die richtige Länge gekürzt werden. Dabei stutzen spezielle Nukleasen die losen Enden so zurecht, dass Überhänge der 3'-Enden der DNA entstehen.

    Nukleasen sind spezielle Enzyme, die Nukleinsäuren – also DNA und RNA – zersetzen können. Als Enzyme werden spezielle Proteine bezeichnet, die Reaktionen in Organismen beschleunigen oder durchführen können, indem sie die dafür benötigte Energie verringern.

    Austausch der Stränge

    Sobald der beschädigte Strang passende Überhänge hat, kommt die zweite, identische DNA zum Einsatz. Der neu geschaffene Überhang schlängelt sich zwischen die beiden Stränge der intakten DNA und sucht nach einer komplementären Sequenz, die er durch Basenpaarung binden kann.

    Damit zwei Einzelstränge zu einer doppelsträngigen DNA zusammengehalten werden können, müssen die Sequenzen jeweils komplementär zueinander sein. Jede Base hat auch eine komplementäre Base – Adenin hat Thymin und Cytosin hat Guanin. Diese Basenpaare können in einem Doppelstrang Wasserstoffbrücken zwischen sich ausbilden, wodurch sie zusammengehalten werden. Da zwischen nicht komplementären Sequenzen keine Wasserstoffbrücken ausgebildet werden, können die Stränge an dieser Stelle auch nicht zusammengehalten werden.

    Da die Reparatur der DNA möglichst fehlerfrei ablaufen sollte, hat sich die Natur für den Strangaustausch einen besonderen Mechanismus ausgedacht: Es werden immer drei Basenpaare neu gebunden und überprüft, ob sie ihre komplementären Partner gefunden haben. Auf diese Weise kann sichergegangen werden, dass selbst die kleinsten Abweichungen erkannt und der Prozess ansonsten abgebrochen wird. Sind alle drei Basen komplementär, werden die nächsten drei gebunden und überprüft, bis eine Sequenz von mindestens 15 Basenpaaren den Strangaustausch stabilisiert.

    Elongation des gekürzten Stranges

    Nach der erfolgreichen Bindung an eine komplementäre Sequenz kann die Elongation des defekten Stranges beginnen. Bei der Elongation bindet eine DNA Polymerase an den Strang und fängt an, Nukleotide aneinanderzuhängen, die den Strang verlängern. Als Vorlage wird dazu die Sequenz genommen, an die der Strang zuvor gebunden hat. Die Nukleotide beinhalten Base, die jeweils komplementär zum intakten Strang sind. Auf diese Weise kann der Strang vorlagengetreu wiederhergestellt werden.

    Für mehr Informationen über diesen Prozess des Strangwachstums kannst Du in den StudySmarter-Artikeln zur DNA Polymerase, Nukleinbasen oder der DNA Replikation vorbeischauen!

    Ist der neue Strang weit genug zusammengebaut, kann er sich vom intakten Strang lösen. Der Rest des Prozesses kann nun ohne den homologen, intakten Doppelstrang stattfinden.

    Fertigstellung der homologen Rekombinationsreparatur

    Hat sich der zu reparierende Strang vom intakten Strang gelöst, kann die Reparatur fortgesetzt werden. Jetzt ist die andere Seite des Doppelstranges an der Reihe: Hier kann der gekürzte Strang auch neu synthetisiert werden, die komplementäre Vorlage dafür ist die andere Seite des Doppelstrangs, die schon mithilfe des intakten Stranges gebildet wurde. Nachdem beide Stränge fertig gebaut sind, müssen nur noch die Lücken zu den intakten Sequenzen geschlossen werden. Diese Aufgabe übernehmen Ligasen.

    Da eine DNA Polymerase Nukleotide nur an das 3' Ende eines Stranges hängen kann, ist sie nicht dazu fähig, die entstehende Lücke zu schließen. Dafür müsste sie auch eine Verbindung zum 5' Ende der intakten Sequenz herstellen können. Für diese Aufgabe werden daher DNA Ligasen genutzt, die gezielt solche Verknüpfungen bilden können.

    Homologen Rekombination – Funktionen

    Die homologe Rekombination beschreibt einen Mechanismus, der in Zellen zur Erhaltung der Erbinformation und auch für die Gendiversität genutzt wird.

    Homologe Rekombination – bei Schäden und Doppelstrangbrüchen in der DNA

    Sollte die DNA einen Doppelstrangbruch erleiden, ist die homologe Rekombination eine geeignete Methode, um den Schaden aufzuheben. Doppelstrangbrüche können durch äußere Einflüsse herbeigeführt werden. Dazu zählen unter anderem UV-Strahlung oder verschiedene chemische Reaktionen.

    Ein anderer Fall, bei dem die homologe Rekombination von Nutzen ist, sind Schäden an der Replikationsgabel.

    Die Replikationsgabel beschreibt die Stelle eines DNA-Doppelstrangs, der während der Replikation aufgedreht wird, um die DNA Replikation besser durchführen zu können. Diese Replikationsgabel bewegt sich während des Prozesses an der DNA entlang, um die gesamte Sequenz für die Replikationsmaschinerie zugänglich zu machen.

    Sollte an einer Stelle der DNA ein Einzelstrangbruch oder ein fehlendes Nukleotid vorkommen, fällt der Strang ab, sobald die Replikationsgabel diese Stelle erreicht. Dieses Problem kann dann durch die homologe Rekombination wieder behoben werden.

    Für die homologe Rekombination ist es wichtig, dass ein identischer, intakter Strang als Vorlage für die Neusynthese genommen wird. Es sollte also ein Schwesterchromatid verwendet werden. Manchmal ist dies jedoch nicht der Fall, und die Zelle verwendet dieselbe Stelle eines Chromatids vom anderen Elternteil. Die DNA von Vater und Mutter unterscheiden sich in manchen Sequenzen, weshalb die kaputte Stelle „falsch“ zusammengebaut werden würde und die Sequenzen des einen Elternteils an dieser Stelle ausgelöscht wäre. Dieser Vorgang wird auch als Verlust der Heterozygotie bezeichnet.

    Für eine Auffrischung des Begriffs der Heterozygotie, kannst Du im StudySmarter-Artikel zu homozygot und heterozygot nachschauen!

    Das kann fatale Folgen haben, wenn sich im Genom des anderen Elternteils eine unerwünschte Mutation befindet, die bisher durch das zweite „gute“ Genom ausgeglichen wurde. Der Verlust der Heterozygotie kann dadurch sogar zu Tumoren und Krebs führen.

    Homologe Rekombination – Funktion bei der Meiose

    Die homologe Rekombination wird nicht nur für Reparaturzwecke genutzt, sondern hat auch eine wichtige Aufgabe bei der Meiose.

    Als Meiose wird der Prozess der Zellteilung beschrieben, bei dem eine befruchtete Eizelle mit doppeltem Chromosomensatz zu zwei Tochterzellen mit einfachem Chromosomensatz getrennt wird. Da von väterlicher und mütterlicher Seite je ein Chromosomensatz bereitgestellt wird, muss der Chromosomensatz geteilt werden. Einen tieferen Einblick in diesen Prozess erhältst Du in den Artikeln zur Meiose.

    Während der Meiose wird homologe Rekombination angewendet, um zwischen den väterlichen und mütterlichen Chromosomen Gene auszutauschen. Auf diese Weise kommt es zu neu kombinierten Chromosomen mit einem Chromosomensatz, der nur aus den väterlichen und mütterlichen Chromosomen zusammengewürfelt ist. Dieser Mechanismus wird auch als crossing over bezeichnet. Im Gegensatz zur DNA Reparatur muss hier zunächst gezielt ein Doppelstrangbruch herbeigeführt werden.

    Homologe Rekombination – Funktion bei Viren

    Viren haben oft das Problem, dass die Organismen, die sie infizieren, mit der Zeit immun gegen sie werden. Das Immunsystem merkt sich, wie diese Viren von außen „aussehen“ und kann daher besser gegen sie vorgehen. Um dem Immunsystem oder Medikamenten zu entgehen und sich weiter verbreiten zu können, haben Viren daher die Fähigkeit, ihr Genom schnell leichten Veränderungen zu unterziehen. Diese Maßnahme ist primär bei Viren verbreitet, deren genetische Information auf RNA codiert ist, da in dieser öfter zufällige Mutationen auftauchen können als in der DNA.

    DNA und RNA haben kleine Unterschiede, die im Artikel Unterschied DNA RNA nochmals aufgeführt sind. Außerdem kannst Du nähere Informationen zu Viren und ihrer Replikation im StudySmarter-Artikel zu Viren finden.

    Eine Methode, ihr Genom zu diversifizieren ist die Einbringung von zufälligen Mutationen, bei denen sich einzelne Basen verändern. Eine andere Methode ist die Einbringung neuer Sequenzen ins Genom durch die homologe Rekombination. Die Voraussetzung dafür ist die Infektion einer Zelle durch zwei verschiedene Viren. Wichtig dabei ist, dass homologe Rekombination nur dann vorliegt, wenn Sequenzen an denselben Stellen der Genome der zwei Viren ausgetauscht werden. Fälle, bei denen genetisches Material von verschiedenen Stellen ausgetauscht wird, können zwar trotzdem als Rekombination bezeichnet werden, allerdings nicht als homologe.

    Fehlfunktion und Defizienz der homologen Rekombination

    Die korrekte Reparatur eines DNA Doppelstrangs ist maßgeblich für das weitere Überleben einer Zelle. Daher ist es umso gravierender, wenn die homologe Rekombination nicht mehr so funktioniert, wie sie sollte. Die Zellen mancher Menschen sind nicht mehr dazu fähig, die homologe Rekombination immer fehlerfrei durchzuführen. Es kommt zu falsch zusammengebauten DNA Strängen und daher zu Mutationen im Erbgut. Dieser Zustand wird auch als Defizienz der homologen Rekombination (HRD) bezeichnet.

    Die Ursache für eine HRD ist meistens genetisch bedingt. Durch den Ausfall bestimmter Gene kann die Funktion der homologen Rekombination beeinträchtigt werden, wodurch eine HRD entsteht. Als Folge der vermehrten Mutationen in Zellen sind Menschen mit einer HRD anfällig für Tumore, vorwiegend in den Eierstöcken. Kommt es zu so einem Fall, spricht man auch von Eierstockkrebs.

    Homologe Rekombination – Gentechnische Anwendungen

    Die homologe Rekombination wird nicht nur in natürlichen Prozessen diverser Organismen genutzt, sondern auch für Anwendungen der Gentechnik. Da nur die Sequenz der Bindungsstelle eines kaputten Stranges mit der des intakten Stranges übereinstimmen muss, kann sich dieser Prozess zunutze gemacht werden. Es können gewünschte Sequenzen in die Genome mancher Organismen eingebracht oder unerwünschte herausgeholt werden. Die dabei entstehende DNA wird auch als rekombinante DNA bezeichnet.

    Rekombinante DNA kann in verschiedene Organismen eingebracht werden, um sogenannte transgene Organismen hervorzubringen – Organismen, in deren Genom DNA aus anderen Lebewesen enthalten ist.

    Im StudySmarter-Artikel zur Herstellung rekombinanter DNA findest Du Erklärungen zu den verschiedenen Methoden, die dafür angewendet werden können.

    Transgene Organismen sind hauptsächlich in der Industrie und der Forschung wichtig.

    Indem etwa Gene für bestimmte Proteine in Bakterien eingebracht werden, können diese Proteine in großem Maßstab produziert werden. Da sich Bakterien schnell vermehren und nicht allzu aufwendig zu halten sind, bieten sie sich besser als Produzenten bestimmter Proteine an, als etwa Tiere.

    Vanillin ist eine Substanz, die nicht nur als Geschmacksträger in Lebensmitteln, sondern auch als Geruchsstoff, für Herbizide oder pharmazeutische Anwendungen genutzt wird. Da chemisch hergestelltes Vanillin nicht rein genug ist, um als Lebensmittelzusatz genutzt zu werden, mussten andere Methoden gefunden werden, die billiger sind als die Nutzung echter Vanilleschoten. Daher werden heutzutage große Mengen des in Lebensmitteln genutzten Vanillins in Mikroorganismen wie Bakterien produziert. Dafür werden verschiedene Gene eingebracht und ausgeschaltet:

    • Einbringung von Genen, durch die Vorgängerstoffe von Vanillin produziert werden
    • Einbringung von Genen, durch die Vorgängerstoffe über mehrere Schritte zu Vanillin umgewandelt werden
    • Ausschalten von Genen, durch die der Vorgängerstoff anderweitig genutzt werden würde
    Auf diese Weise wird sichergegangen, dass die größtmögliche Menge Vanillin produziert wird. Das praktische: In der EU gilt nicht nur Vanillin aus der Vanille-Schote als natürlich. Auch Vanillin, das in Mikroorganismen produziert wird, darf als natürlich-identisch bezeichnet und vertrieben werden. Allerdings brauchst Du Dir keine Sorgen zu machen, Dir beim nächsten Mal Backen mit Vanillin-Zucker eine Bakterieninfektion einzufangen. Für den Prozess dürfen nur ungefährliche Mikroorganismen genutzt werden und die Gewinnung des Vanillin aus den Bakterien ist so optimiert, dass am Ende pures Vanillin erhalten wird.

    Wird ein Gen im Wirt durch homologe Rekombination verändert – egal ob es danach verändert oder gar nicht mehr vorhanden ist – wird der Prozess auch als gene targeting bezeichnet.

    Gene targeting und knock-out durch homologe Rekombination

    Für das gezielte Verändern oder Ausschalten von Genen – auch genannt knock-out – durch homologe Rekombination müssen einige Punkte beachtet werden.

    • Das neu einzubringende Gen muss zunächst in einen Vektor eingebracht werden. Vektoren sind Plasmide, also kreisförmige DNA Stränge, in die das gewünschte Gen eingebaut wird. Dieser Vektor kann später vom zu verändernden Organismus aufgenommen werden.
    • Da homologe Rekombination voraussetzt, dass ein Strang einen Bruch hat, müssen vor dem eigentlichen Prozess Restriktionsenzyme angewendet werden. Das sind Enzyme, die DNA an einer ganz bestimmten Stelle aufschneiden können. Dafür binden sie an eine vorher definierte Basensequenz und schneiden dort wie eine Schere durch den DNA-Strang.
    • Das Einbringen eines Gens durch homologe Rekombination funktioniert nur in seltenen Fällen. Um im weiteren Verlauf genau die Zellen auswählen zu können, in die das gewollte Gen eingebaut wurde, muss der Vektor entsprechend konstruiert werden.

    Konstruktion des richtigen Vektors

    Ein Vektor, der für die homologe Rekombination genutzt wird, muss bestimmte Gene enthalten. Diese müssen sich an der Sequenz orientieren, die an der gewünschten Stelle im Genom bereits vorhanden ist. Die bereits im Genom des Zielorganismus vorhandene Sequenz kann dabei folgendermaßen aussehen.

    Die Sequenz, an der die Bindung für die homologe Rekombination stattfindet, muss zwingend homolog, also identisch, zu der Sequenz im Vektor sein. Ansonsten sollte der Vektor folgende Sequenzen enthalten.

    1. Das neu einzubringende Gen. Dieses Gen muss nicht unbedingt ein komplett neues Gen sein. Es kann auch schon im Organismus enthalten sein, aber auf dem Vektor eine Mutation enthalten, die die Funktion verändern oder ausschalten würde.
    2. Zwei Bindungssequenzen, die mit den Sequenzen im Zielgenom übereinstimmen.
    3. Ein Markergen zwischen den Bindungssequenzen. Dieses wird im Rahmen der homologen Rekombination mit in das Zielgenom eingebaut.

      In Bakterien kann dieses Markergen zum Beispiel für eine Antibiotika-Resistenz codieren. Nach dem Prozess der homologen Rekombination können die Bakterien auf einer Platte verteilt werden, die dieses Antibiotikum enthält. Nur Bakterien, die den Vektor eingebaut haben, sollten resistent sein. Diese Bakterien fangen an, in Kolonien zu wachsen und mit ihnen können die Experimente fortgeführt werden. Alle anderen Bakterien ohne die Resistenz sterben.

    4. Ein Markergen außerhalb der Zielsequenzen. Dieses sollte nicht ins Genom eingebaut werden.

      In Bakterien kann hierfür etwa das Gen sacB eingebaut werden. Es kodiert für das Enzym Levansucrase, das in Anwesenheit von Sucrose einen toxischen Stoff produziert. Ist die Zielsequenz durch homologe Rekombination eingebaut worden, dann sollte dieses Gen nicht eingebaut worden sein, da es außerhalb der Bindungssequenzen lag. Ist der Genabschnitt allerdings auf andere Weise eingebaut worden – und daher vielleicht auch gar nicht an seinem eigentlichen Ziel –, ist dieses Markergen nun im Genom des Zielorganismus enthalten. Die Platte, auf der die Bakterien als Nächstes ausgestrichen werden, enthält daher Sucrose, um die Reaktion der wachsenden Kolonien darauf beobachten zu können. Bakterien, die dieses Markergen eingebaut haben, stellen Levansucrase her, das wiederum einen toxischen Stoff produziert. Diese Bakterien sterben.

    Da die Anwendung der homologen Rekombination aufwendig ist und keine hohe Einbaufrequenz aufweist, werden heutzutage zum gezielten Einbau von Genen allerdings andere Methoden genutzt. Dazu gehören insbesondere die Nutzung des CRISPR/Cas9 Systems oder Zinkfingernukleasen.

    Das CRISPR/Cas9 System kann genutzt werden, um die DNA sequenzspezifisch aufzuschneiden. Es wird daher auch als Genschere bezeichnet.

    Homologe Rekombination – Das Wichtigste

    • Homologe Rekombination ist ein Mechanismus, mit dem Doppelstrangbrüche der DNA repariert werden können.
    • Für die homologe Reparatur wird ein intakter DNA-Strang benötigt, nach dessen Vorlage die kaputte DNA wieder aufgebaut werden kann.
    • Bei der Meiose wird die homologe Rekombination zum Austausch der Gene von väterlichen und mütterlichen Chromosome genutzt.
    • Um eine homologe Rekombination einzuleiten, bindet ein Strang der kaputten DNA an eine homologe (identische) Sequenz der intakten DNA und wird nach ihrer Vorlage wieder zusammengebaut. Der zweite Strang kann anschließend anhand der Vorlage des neu aufgebauten Strangs zusammengesetzt.
    • In der Gentechnik kann sich die homologe Rekombination zunutze gemacht werden, um gezielt neue Gene in ein Genome einzubringen, oder bereits vorhandene zu verändern oder auszuschalten (knock-out).

    Nachweise

    1. Alberts et al. (2015). Molecular Biology of the Cell. W.W. Norton & Company.
    2. Pérez-Losada et al. (März, 2015). Recombination in viruses: mechanisms, methods of study, and evolutionary consequences. Infection, genetics and evolution: Journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases.
    3. Jennifer Tsang (2019). Plasmids 101: Positive and Negative Selection for Plasmid Cloning. blog.addgene.org
    4. Stefanie Pöggeler (2007). DNA-Rekombinationstechnik. gobics.de (27.05.2022)
    Häufig gestellte Fragen zum Thema Homologe Rekombination

    Wann findet homologe Rekombination statt? 

    Die homologe Rekombination ist ein Reparaturmechanismus von Zellen, der zum Einsatz kommt, wenn die DNA einen Doppelstrangbruch erleidet. Die homologe Rekombination wird dabei genutzt, um die DNA fehlerfrei wieder zusammenzubauen. 
    Eine weitere Anwendung findet die homologe Rekombination während der Meiose. 

    Wie erfolgt homologe Rekombination?

    Bei der homologen Rekombination muss sich ein DNA Strang mit Doppelstrangbruch zunächst neben einem intakten Strang mit homologer (identischer) Sequenz positionieren. Einer seiner Stränge schlängelt sich zwischen die intaktem Stränge und bindet an die komplementäre Sequenz. Die fehlenden Basen werden anhand der Vorlage des intakten Stranges an den kaputten Strang angehängt. Der zweite defekte Strang kann dann anhand der Vorlage des neu zusammengesetzten Strangs zusammengebaut werden.

    Wie kann es zwischen Bakterien zu einer homologen Rekombination kommen? 

    Bakterien werden in der Gentechnik oft genutzt, um durch homologe Rekombination Gene in einen Zielorganismus einzubringen. Diese können entweder komplett neue oder veränderte Gene sein. Auch das Ausschalten (knock-out) eines Gens ist möglich. Den Bakterien wird ein Vektorplasmid eingeführt, das das gewünschte Gen, Markergene und homologe Bindungssequenzen enthält. Durch die homologen Sequenzen kann der Vektor dann von den Bakterien ins Zielgenom übertragen werden.

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