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Koloniehybridisierung

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Koloniehybridisierung

Die Koloniehybridisierung ist ein eher unbekanntes Verfahren der Gentechnik. Nichtsdestotrotz wird es gerade in der Lebensmitteltechnik seit mehreren Jahren immer häufiger genutzt. Die Koloniehybridisierung wird auch als Grunstein-Hogness-Technik bezeichnet, und wird oftmals angewandt, um eine Identifikation von Bakterienkolonien durchzuführen.

Definition zur Koloniehybridisierung

Die DNA-Koloniehybridisierung ist ein Testverfahren, um bestimmte Gensequenzen (also Merkmale) aus der DNA herauszufiltern. Ebenso ist es eine Methode, um lebende Bakterien in Lebensmitteln aufzufinden.

Durch das Verfahren der Koloniehybridisierung ist es möglich, auf über Tausend Bakterienkolonien gleichzeitig zu testen, während das Testobjekt auf einer Membran fixiert, also festgehalten, wird.

Das Prinzip der Koloniehybridisierung findet auch Anwendung bei der sogenannten Plaque-Hybridisierung. Die Plaque-Hybridisierung ist ein Verfahren, welches genutzt wird um festzustellen, ob "Plaques" durch sogenannte Bakteriophagen entstanden sind. Bakteriophagen sind bakterienfressende Viren.

Plaques sind durch Viren entstandene Zonen in den Testbereichen der Koloniehybridisierung.

Bedeutung der Koloniehybridisierung

Bisher wurde die Koloniehybridisierung hauptsächlich in der Lebensmittelforschung genutzt. Mit ihr war es möglich, Lebensmittel in kurzer Zeit auf verschiedenste, lebende Bakterienkolonien zu prüfen. Seit Ende des 21. Jahrhunderts hat sich das Nutzungsgebiet auch auf die Abwasserforschung erweitert. Die Prüfung des Abwassers mithilfe der Koloniehybridisierung bringt zuverlässige Ergebnisse, um die Wasserqualität zu prüfen.

Ebenso wird die Koloniehybridisierung auch im medizinischen Sektor angewandt.

Ein deutscher Forscher aus Ulm bezeichnete das Vorkommen von HIV 1 Viren-DNS in deutschen Gewässern in 1990 als sehr unwahrscheinlich. Bereits 2 Jahre später, 1992, war es einem Forscherteam aus den USA allerdings möglich, durch die Kolonoehybridisierung im Abflusswasser aus Michigan und Florida HIV 1 Viren-DNS sowie RNS nachzuweisen.

Nichtsdestotrotz galt das Ergebnis zur damaligen Zeit als Meilenstein in der Technik der Koloniehybridisierung. Grundsätzlich wird der Nachweis von HIV-Viren hauptsächlich über PCR-Testungen (polymerase chain reaction) durchgeführt.

Ein großer Nachteil der DNA-Koloniehybridisierung ist, dass vor Anwendung eine Kultivierung der Bakterien notwendig ist. Bei der Kultivierung wachsen die Bakterien unter kontrollierten Bedingungen, wie bei einer bestimmten Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Dies ist einerseits nicht nur zeitaufwendiger, sondern bringt auch den Nachteil mit, dass höchstens 15% aller Organismen auf die Kultivierung anspringen. Das hat zur Folge, dass möglicherweise nicht alle Bakterien durch die Koloniehybridisierung erkannt werden.

Aus diesem Grund wird oftmals die Dot-Blot-Hybridisierung der Koloniehybridisierung vorgezogen. Bei dieser Methode ist eine vorherige Kultivierung nicht notwendig.

Ablauf der Koloniehybridisierung

Die DNA-Koloniehybridisierung ist ein Verfahren, das im Vergleich zur DNA-Hybridisierung in Lösungen in festen Phasen erfolgt.

Die DNA-Hybridisierung ist ein Prozess, bei welchem ein DNA-Doppelstrang aus zwei einzelnen Strängen unterschiedlicher Herkunft entsteht. Dabei kann es Hybride aus zwei DNA-Strängen geben, ebenso aber auch Hybride aus einem DNA- und einem RNA-Strang. Mehr zur DNA-Hybridisierung findest du im passenden StudySmarter Artikel!

Bei der Koloniehybridisierung werden Bakterienkolonien auf einen Filter oder eine Membran gelegt. Daraufhin folgt die Freilegung der DNA durch die Bakterienlyse. Ebenso wird die DNA denaturiert und auf der Membran fixiert. Im Anschluss folgt die Hybridisierung, bei der sich eine beigefügte Sonde mithilfe von Wasserstoffbrückenbindungen an einen DNA-Einzelstrang bindet.

Eine Sonde ist ein kurzes DNA- oder RNA-Fragment, welches einzelsträngig ist und genutzt wird, um einen bestimmten Abschnitt der zu untersuchenden DNA oder RNA zu detektieren. Durch ihre Komplementarität zueinander können sich zwischen den beiden Strängen Wasserstoffbrücken bilden.

Die Sonden sind immer entweder radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert, damit sie bei Beendigung des Prozesses gut sichtbar sind. Zuletzt werden Sonden, welche sich nicht an einen DNA-Einzelstrang gebunden haben, abgewaschen. Im letzten Schritt werden die Sonden mithilfe von zwei unterschiedlichen Methoden, auf die unten eingegangen wird, sichtbar gemacht.

1. Schritt: Bakterienlyse

Die Bakterienlyse beschreibt das Auflösen der Zellwand des Bakteriums. Dabei gibt es verschiedene Möglichkeiten, um dies zu erreichen: Wichtig ist nur, dass der pH-Wert angehoben wird, und die Temperatur steigt. Auch eine Nutzung von UV-Strahlen ist möglich, um die Zellwand aufzulösen. Oftmals werden für diesen Prozess Natriumhydroxid und Dampf, oder Mikrowellenstrahlung verwendet. Um mögliche Rückstände der Zelle zu entfernen, nutzt man die Proteinase K.

2. Schritt: Denaturierung

Fast gleichzeitig zur Bakterienlyse erfolgt auch die Denaturierung der DNA. Die Denaturierung bewirkt das Aufspalten des DNA-Doppelstrangs in seine beiden Einzelstränge, indem die Wasserstoffbrückenbindungen gelöst werden. Dafür ist lediglich eine Temperatur über 94 Grad Celsius notwendig. Diese kann zum Beispiel mit Dampf oder Mikrowellenstrahlung erreicht werden.

3. Schritt: Fixation der DNA

Die Fixation der DNA wird ebenfalls durch das Anheben des pH-Werts mit gleichzeitig steigender Temperatur gesichert. Die Fixation bewirkt, dass die DNA an ihren Ort gebunden ist. Sie ist nun also nicht mehr beweglich, sondern fest an die Membran, auf welche die DNA gelegt worden ist, gebunden.

4. Schritt: Zugabe der Sonde

Heutzutage existieren automatisierte Verfahren zur Herstellung von Sonden, die man als synthetische Oligonukleotid-Sonden bezeichnet. Ebenfalls ist es durch Fortschritte in der Forschung möglich, kleinere Sonden herzustellen. Kleinere Sonden haben den Vorteil, dass es unwahrscheinlicher ist, dass sie an mehrere Gene andocken. Ein Andocken an mehrere Gene würde die Sonde unbrauchbar machen.

Die ersten Sonden, die eingesetzt worden sind, waren sogenannte Polynukleotid-Sonden. Die Sonden waren geklont, und wurden in Plasmide eingeführt. Dieser Prozess war jedoch sehr zeitaufwendig und kompliziert.

5. Schritt: Hybridisierung

Bei der Hybridisierung werden zwischen der einsträngigen Sonde und dem DNA-Einzelstrang Wasserstoffbrückenbindungen gebildet. Dabei entsteht ein DNA-Doppelstrang. Bei einer Temperatur von etwa 20 Grad unter dem Schmelzpunkt läuft die Hybridisierung am schnellsten ab.

6. Waschschritte

Durch sogenannte Waschschritte werden die Sonden entfernt, die sich an keinen DNA-Einzelstrang gebunden haben. Bei den Waschschritten ist eine passende Temperatur ausschlaggebend. Sie darf nicht zu hoch sein, damit sich nicht bereits gebundene Wasserstoffbrückenbindungen wieder auflösen, aber auch nicht zu niedrig, da dies zu Basenfehlpaarungen führen kann.

7. Detektion

Die Detektion beschreibt das Aufspüren der zuvor beigefügten Sonden. Dies ist notwendig, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten. Unterschieden wird dabei zwischen Sonden, welche mit einem radioaktiven Stoff markiert worden sind, und jenen, die mit Farbstoffen markiert worden sind.

Radioaktiv-markierte Sonden

Die Sonden, die radioaktiv markiert worden sind, werden mittels Autoradiografie aufgespürt. Dabei wird ein Röntgenfilm auf die Membran gelegt und in einer sogenannten Röntgenkassette platziert. Danach folgt eine mehrstündige Belichtungszeit. Anschließend wird der Film entwickelt. Einen positiven Ausschlag erkennt man dann durch das Vorhandensein von Radioaktivität. Diese ist in Form von kleinen, schwarzen Punkten auf dem Röntgenbild erkennbar.

Mithilfe der Autoradiografie werden chemische Komponenten, in diesem Fall die Sonden, aufgespürt. Heutzutage wird dafür ein Strahlungsdetektor genutzt, welcher die radioaktive Markierung erkennt.

Die Röntgenkassette ist ein Bildauffangsystem, mit welchem es möglich ist, Röntgenbilder einzufangen.

Radioaktiv-markierte Sonden sind sehr sensitiv, doch da ihre Handhabung und die spätere Entsorgung hohen Aufwand und höhere Kosten verursachen, werden sie nur noch selten genutzt.

Nicht-radioaktive Sonden

Bei Sonden, die nicht radioaktiv markiert worden sind, werden meist fluoreszente Farbstoffe genutzt. Dabei kann dieser direkt an die Sonde gekuppelt sein, aber auch indirekt an ein Indikatormolekül angebunden sein. Häufig genutzte Indikatormoleküle sind Biotin, Fluoreszein oder Digoxigenin (DIG). Durch ihre einfachere Handhabung greift man in der modernen Forschung eher auf diese Weise der Markierung zurück. Teilweise ist es sogar möglich, die Sonden bei bis zu -20 Grad Celsius zu lagern, und sie mehrmals wiederzuverwenden, ohne, dass ein Qualitätsverlust einhergeht.

Koloniehybridisierung - Das Wichtigste

  • Die Koloniehybridisierung ist ein Verfahren, um bestimmte Gensequenzen herauszufiltern.
  • Der Ablauf verläuft in sieben festgelegten Phasen.
  • Die Bakterienlyse beschreibt das Auflösen der Zellwand.
  • Die Denaturierung beschreibt das Aufspalten der Doppelstränge in Einzelstränge.
  • Bei der Fixation wird die DNA auf der Membran fixiert.
  • Die Sondenzugabe beschreibt das Dazugeben eines markierten DNA-Moleküls.
  • Als Hybridisierungsschritt bezeichnet man die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen.
  • Nun folgt das Abwaschen nicht angebundener Sonden.
  • Als Detektion bezeichnet man das Aufspüren von markieren Sonden.

Häufig gestellte Fragen zum Thema Koloniehybridisierung

Die DNA-Kolonie-Hybridisierung ist ein Testverfahren, um bestimmte Merkmale (also Gensequenzen) aus der DNA herauszufiltern. Ebenso ist es eine Methode, um Bakterien in beispielsweise Lebensmitteln aufzufinden.

Bei der Koloniehybridisierung werden Kolonien von Bakterien genutzt, um Gensequenzen ausfindig zu machen. Die Hybridisierung sagt dabei aus, dass sich Wasserstoffbrückenbindungen zwischen einem DNA-Einzelstrang und einer Sonde bilden.

Die Koloniehybridisierung wird zum Beispiel für das Erforschen der Bakterien Escherichia coli genutzt.

Die Koloniehybridisierung besteht aus 7 Schritten: Bakterienlyse, Denaturierung, Fixierung, Zugabe der Sonde, Hybridisierung, Waschschritte und Detektion.

Finales Koloniehybridisierung Quiz

Frage

Wo liegen die Anwendungsgebiete der Koloniehybridisierung? 

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Antwort

Die Koloniehybridisierung wird vor allem im medizinischen Sektor und der Lebensmittelforschung genutzt. Seit kurzem hat sich ihr Nutzen auch in der Abwasserforschung bewährt.

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Frage

Welche Art von Bakterien wird mithilfe der Koloniehybridisierung nachgewiesen?

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Antwort

lebende Bakterien

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Frage

Fasse kurz den Ablauf der Koloniehybridisierung zusammen: 


Antwort anzeigen

Antwort

Bei der Koloniehybridisierung werden Bakterienkolonien auf einen Filter oder eine Membran gelegt. Daraufhin folgt die Freilegung der DNA durch die Bakterienlyse. Ebenso wird die DNA denaturiert und auf der Membran fixiert. Im Anschluss folgt die Hybridisierung, bei welcher sich eine beigefügte Sonde mithilfe von Wasserstoffbrückenbindungen an einen DNA-Einzelstrang bindet. 

Zuletzt werden Sonden, welche sich nicht an einen DNA-Einzelstrang gebunden haben abgewaschen. Im letzten Schritt werden die Sonden mithilfe von zwei unterschiedlichen Methoden, auf die unten eingegangen wird, sichtbar gemacht.

Frage anzeigen

Frage

Was ist die Bakterienlyse? 


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Antwort

Die Bakterienlyse beschreibt das Auflösen der Zellwand des Bakteriums.  Oftmals werden für diesen Prozess Natriumhydroxid und Dampf oder Mikrowellenstrahlung verwendet.  

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Frage

Was erfolgt im Schritt der Denaturierung? 


Antwort anzeigen

Antwort

Fast gleichzeitig zur Bakterienlyse erfolgt auch die Denaturierung der DNA. Dafür ist lediglich eine Temperatur über 94 Grad Celsius notwendig. Diese kann zum Beispiel mit Dampf oder Mikrowellenstrahlung erreicht werden. 

Frage anzeigen

Frage

Wie wird die DNA fixiert? 


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Antwort

Die Fixation der DNA wird durch das Anheben des pH-Werts mit gleichzeitig steigender Temperatur gesichert. 

Frage anzeigen

Frage

Wie hießen die ersten Sonden, die bei der Koloniehybridisierung verwendet wurden?


Antwort anzeigen

Antwort

Die ersten Sonden, die eingesetzt worden sind, waren sogenannte Polynukleotid-Sonden. Die Sonden waren geklont, und wurden in Plasmide eingeführt.  

Frage anzeigen

Frage

Was passiert während der Hybridisierung? 


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Antwort

Bei der Hybridisierung werden zwischen der einsträngigen Sonde und dem DNA-Einzelstrang Wasserstoffbrückenbindungen gebildet. Dabei entsteht ein DNA-Doppelstrang.  

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Frage

Wofür werden die Waschschritte genutzt? 


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Antwort

Durch sogenannte Waschschritte werden die Sonden entfernt, die sich an keinen DNA-Einzelstrang gebunden haben.  

Frage anzeigen

Frage

Wie werden radioaktiv markierte Sonden aufgespürt? 


Antwort anzeigen

Antwort

Die Sonden, die meist radioaktiv markiert worden sind, werden mittels Autoradiographie aufgespürt. Dabei wird ein Röntgenfilm auf die Membran gelegt und in einer sogenannten Röntgenkassette platziert. Danach folgt eine mehrstündige Belichtungszeit. Anschließend wird der Film entwickelt. Einen positiven Ausschlag erkennt man dann durch das Vorhandensein von Radioaktivität.  

Frage anzeigen

Frage

Wie detektiert man nicht radioaktive Sonden?


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Antwort

Bei Sonden, die nicht radioaktiv markiert worden sind, werden meist fluoreszente Farbstoffe genutzt. Dabei kann dieser direkt an die Sonde gekuppelt sein, aber auch indirekt an ein Indikatormolekül angebunden sein.  

Frage anzeigen

Frage

Was war einem Forscherteam möglich, mithilfe der Koloniehybridisierung zu entdecken?

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Antwort

Durch die Koloniehybridisierung war es einem Forscherteam möglich, im Abflusswasser aus Michigan HIV 1 Viren nachzuweisen.  

Frage anzeigen

Frage

Nenne einen Nachteil der Koloniehybridisierung:

Antwort anzeigen

Antwort

Ein großer Nachteil der DNA-Koloniehybridisierung ist, dass vor Anwendung eine Kultivierung der Bakterien notwendig ist. Bei der Kultivierung wachsen die Bakterien unter kontrollierten Bedingungen, wie einer bestimmten Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Dies ist einerseits nicht nur zeitaufwendiger, sondern bringt auch den Nachteil mit, dass höchstens 15% aller Organismen auf die Kultivierung anspringen. 

Frage anzeigen

Frage

Was ist eine Sonde?

Antwort anzeigen

Antwort

Eine Sonde ist ein kurzes DNA- oder RNA-Fragment, welches einzelsträngig ist und genutzt wird, um einen bestimmten Abschnitt der zu untersuchenden DNA oder RNA zu detektieren. Durch ihre Komplementarität zueinander können sich zwischen den beiden Strängen Wasserstoffbrücken bilden.

Frage anzeigen

Frage

Was ist der Nachteil radioaktiv-markierter Sonden?

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Antwort

Radioaktiv-markierte Sonden sind sehr sensitiv, doch da ihre Handhabung und die spätere Entsorgung hohen Aufwand und höhere Kosten verursachen, werden sie nur noch selten genutzt. 

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