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Die Koloniehybridisierung ist ein eher unbekanntes Verfahren der Gentechnik. Nichtsdestotrotz wird es gerade in der Lebensmitteltechnik seit mehreren Jahren immer häufiger genutzt. Die Koloniehybridisierung wird auch als Grunstein-Hogness-Technik bezeichnet, und wird oftmals angewandt, um eine Identifikation von Bakterienkolonien durchzuführen.
Die DNA-Koloniehybridisierung ist ein Testverfahren, um bestimmte Gensequenzen (also Merkmale) aus der DNA herauszufiltern. Ebenso ist es eine Methode, um lebende Bakterien in Lebensmitteln aufzufinden.
Durch das Verfahren der Koloniehybridisierung ist es möglich, auf über Tausend Bakterienkolonien gleichzeitig zu testen, während das Testobjekt auf einer Membran fixiert, also festgehalten, wird.
Das Prinzip der Koloniehybridisierung findet auch Anwendung bei der sogenannten Plaque-Hybridisierung. Die Plaque-Hybridisierung ist ein Verfahren, welches genutzt wird um festzustellen, ob "Plaques" durch sogenannte Bakteriophagen entstanden sind. Bakteriophagen sind bakterienfressende Viren.
Plaques sind durch Viren entstandene Zonen in den Testbereichen der Koloniehybridisierung.
Bisher wurde die Koloniehybridisierung hauptsächlich in der Lebensmittelforschung genutzt. Mit ihr war es möglich, Lebensmittel in kurzer Zeit auf verschiedenste, lebende Bakterienkolonien zu prüfen. Seit Ende des 21. Jahrhunderts hat sich das Nutzungsgebiet auch auf die Abwasserforschung erweitert. Die Prüfung des Abwassers mithilfe der Koloniehybridisierung bringt zuverlässige Ergebnisse, um die Wasserqualität zu prüfen.
Ebenso wird die Koloniehybridisierung auch im medizinischen Sektor angewandt.
Ein deutscher Forscher aus Ulm bezeichnete das Vorkommen von HIV 1 Viren-DNS in deutschen Gewässern in 1990 als sehr unwahrscheinlich. Bereits 2 Jahre später, 1992, war es einem Forscherteam aus den USA allerdings möglich, durch die Kolonoehybridisierung im Abflusswasser aus Michigan und Florida HIV 1 Viren-DNS sowie RNS nachzuweisen.
Nichtsdestotrotz galt das Ergebnis zur damaligen Zeit als Meilenstein in der Technik der Koloniehybridisierung. Grundsätzlich wird der Nachweis von HIV-Viren hauptsächlich über PCR-Testungen (polymerase chain reaction) durchgeführt.
Ein großer Nachteil der DNA-Koloniehybridisierung ist, dass vor Anwendung eine Kultivierung der Bakterien notwendig ist. Bei der Kultivierung wachsen die Bakterien unter kontrollierten Bedingungen, wie bei einer bestimmten Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Dies ist einerseits nicht nur zeitaufwendiger, sondern bringt auch den Nachteil mit, dass höchstens 15% aller Organismen auf die Kultivierung anspringen. Das hat zur Folge, dass möglicherweise nicht alle Bakterien durch die Koloniehybridisierung erkannt werden.
Aus diesem Grund wird oftmals die Dot-Blot-Hybridisierung der Koloniehybridisierung vorgezogen. Bei dieser Methode ist eine vorherige Kultivierung nicht notwendig.
Die DNA-Koloniehybridisierung ist ein Verfahren, das im Vergleich zur DNA-Hybridisierung in Lösungen in festen Phasen erfolgt.
Die DNA-Hybridisierung ist ein Prozess, bei welchem ein DNA-Doppelstrang aus zwei einzelnen Strängen unterschiedlicher Herkunft entsteht. Dabei kann es Hybride aus zwei DNA-Strängen geben, ebenso aber auch Hybride aus einem DNA- und einem RNA-Strang. Mehr zur DNA-Hybridisierung findest du im passenden StudySmarter Artikel!
Bei der Koloniehybridisierung werden Bakterienkolonien auf einen Filter oder eine Membran gelegt. Daraufhin folgt die Freilegung der DNA durch die Bakterienlyse. Ebenso wird die DNA denaturiert und auf der Membran fixiert. Im Anschluss folgt die Hybridisierung, bei der sich eine beigefügte Sonde mithilfe von Wasserstoffbrückenbindungen an einen DNA-Einzelstrang bindet.
Die Sonden sind immer entweder radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert, damit sie bei Beendigung des Prozesses gut sichtbar sind. Zuletzt werden Sonden, welche sich nicht an einen DNA-Einzelstrang gebunden haben, abgewaschen. Im letzten Schritt werden die Sonden mithilfe von zwei unterschiedlichen Methoden, auf die unten eingegangen wird, sichtbar gemacht.
Die Bakterienlyse beschreibt das Auflösen der Zellwand des Bakteriums. Dabei gibt es verschiedene Möglichkeiten, um dies zu erreichen: Wichtig ist nur, dass der pH-Wert angehoben wird, und die Temperatur steigt. Auch eine Nutzung von UV-Strahlen ist möglich, um die Zellwand aufzulösen. Oftmals werden für diesen Prozess Natriumhydroxid und Dampf, oder Mikrowellenstrahlung verwendet. Um mögliche Rückstände der Zelle zu entfernen, nutzt man die Proteinase K.
Fast gleichzeitig zur Bakterienlyse erfolgt auch die Denaturierung der DNA. Die Denaturierung bewirkt das Aufspalten des DNA-Doppelstrangs in seine beiden Einzelstränge, indem die Wasserstoffbrückenbindungen gelöst werden. Dafür ist lediglich eine Temperatur über 94 Grad Celsius notwendig. Diese kann zum Beispiel mit Dampf oder Mikrowellenstrahlung erreicht werden.
Die Fixation der DNA wird ebenfalls durch das Anheben des pH-Werts mit gleichzeitig steigender Temperatur gesichert. Die Fixation bewirkt, dass die DNA an ihren Ort gebunden ist. Sie ist nun also nicht mehr beweglich, sondern fest an die Membran, auf welche die DNA gelegt worden ist, gebunden.
Heutzutage existieren automatisierte Verfahren zur Herstellung von Sonden, die man als synthetische Oligonukleotid-Sonden bezeichnet. Ebenfalls ist es durch Fortschritte in der Forschung möglich, kleinere Sonden herzustellen. Kleinere Sonden haben den Vorteil, dass es unwahrscheinlicher ist, dass sie an mehrere Gene andocken. Ein Andocken an mehrere Gene würde die Sonde unbrauchbar machen.
Die ersten Sonden, die eingesetzt worden sind, waren sogenannte Polynukleotid-Sonden. Die Sonden waren geklont, und wurden in Plasmide eingeführt. Dieser Prozess war jedoch sehr zeitaufwendig und kompliziert.
Bei der Hybridisierung werden zwischen der einsträngigen Sonde und dem DNA-Einzelstrang Wasserstoffbrückenbindungen gebildet. Dabei entsteht ein DNA-Doppelstrang. Bei einer Temperatur von etwa 20 Grad unter dem Schmelzpunkt läuft die Hybridisierung am schnellsten ab.
Durch sogenannte Waschschritte werden die Sonden entfernt, die sich an keinen DNA-Einzelstrang gebunden haben. Bei den Waschschritten ist eine passende Temperatur ausschlaggebend. Sie darf nicht zu hoch sein, damit sich nicht bereits gebundene Wasserstoffbrückenbindungen wieder auflösen, aber auch nicht zu niedrig, da dies zu Basenfehlpaarungen führen kann.
Die Detektion beschreibt das Aufspüren der zuvor beigefügten Sonden. Dies ist notwendig, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten. Unterschieden wird dabei zwischen Sonden, welche mit einem radioaktiven Stoff markiert worden sind, und jenen, die mit Farbstoffen markiert worden sind.
Die Sonden, die radioaktiv markiert worden sind, werden mittels Autoradiografie aufgespürt. Dabei wird ein Röntgenfilm auf die Membran gelegt und in einer sogenannten Röntgenkassette platziert. Danach folgt eine mehrstündige Belichtungszeit. Anschließend wird der Film entwickelt. Einen positiven Ausschlag erkennt man dann durch das Vorhandensein von Radioaktivität. Diese ist in Form von kleinen, schwarzen Punkten auf dem Röntgenbild erkennbar.
Mithilfe der Autoradiografie werden chemische Komponenten, in diesem Fall die Sonden, aufgespürt. Heutzutage wird dafür ein Strahlungsdetektor genutzt, welcher die radioaktive Markierung erkennt.
Die Röntgenkassette ist ein Bildauffangsystem, mit welchem es möglich ist, Röntgenbilder einzufangen.
Radioaktiv-markierte Sonden sind sehr sensitiv, doch da ihre Handhabung und die spätere Entsorgung hohen Aufwand und höhere Kosten verursachen, werden sie nur noch selten genutzt.
Bei Sonden, die nicht radioaktiv markiert worden sind, werden meist fluoreszente Farbstoffe genutzt. Dabei kann dieser direkt an die Sonde gekuppelt sein, aber auch indirekt an ein Indikatormolekül angebunden sein. Häufig genutzte Indikatormoleküle sind Biotin, Fluoreszein oder Digoxigenin (DIG). Durch ihre einfachere Handhabung greift man in der modernen Forschung eher auf diese Weise der Markierung zurück. Teilweise ist es sogar möglich, die Sonden bei bis zu -20 Grad Celsius zu lagern, und sie mehrmals wiederzuverwenden, ohne, dass ein Qualitätsverlust einhergeht.
Die DNA-Kolonie-Hybridisierung ist ein Testverfahren, um bestimmte Merkmale (also Gensequenzen) aus der DNA herauszufiltern. Ebenso ist es eine Methode, um Bakterien in beispielsweise Lebensmitteln aufzufinden.
Bei der Koloniehybridisierung werden Kolonien von Bakterien genutzt, um Gensequenzen ausfindig zu machen. Die Hybridisierung sagt dabei aus, dass sich Wasserstoffbrückenbindungen zwischen einem DNA-Einzelstrang und einer Sonde bilden.
Die Koloniehybridisierung wird zum Beispiel für das Erforschen der Bakterien Escherichia coli genutzt.
Die Koloniehybridisierung besteht aus 7 Schritten: Bakterienlyse, Denaturierung, Fixierung, Zugabe der Sonde, Hybridisierung, Waschschritte und Detektion.
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