Sanger Sequenzierung

Zur Entschlüsselung des Genoms, also der Sequenzierung der gesamten DNA einer Zelle, gibt es verschiedene Methoden. Zu den klassischen Methoden der DNA-Entschlüsselung gehört die Sequenzierung nach Sanger.

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsangabe

    Die Sanger-Sequenzierung ist eine Methode der DNA-Sequenzierung, die über eine bestimmte enzymatische Reaktion erfolgt. Durch diese Methode kann die Abfolge der Basenpaare in der DNA bestimmt und somit das Erbgut entschlüsselt werden.

    Kettenabbruchmethode und Didesoxymethode sind weitere Begriffe, welche die Sequenzierung nach Sanger beschreiben.

    Die Sequenzierung nach Sanger gehört zu den klassischen und älteren Methoden zur Entschlüsselung des Genoms. Inzwischen gibt es auch modernere Verfahren, die eine deutlich schnellere Aufschlüsselung ermöglichen; sie werden "Next Generation Sequencing"-Methoden genannt. Zu den NGS-Verfahren gehört z.B. die Pyrosequenzierung.

    Mehr zur Pyrosequenzierung kannst du im gleichnamigen Artikel erfahren.

    Sanger Sequenzierung einfach erklärt

    Um den Ablauf der Sequenzierung nach Sanger zu verstehen, ist es wichtig, zuvor das Grundprinzip im Hinterkopf zu haben: Mithilfe von Enzymen sollen verschieden lange DNA-Stränge nach Vorlage der zu untersuchenden DNA generiert werden. Dabei sollen sich die vielen, unterschiedlich langen DNA-Stränge um jeweils nur ein Basenpaar unterscheiden.

    Sanger Sequenzierung DNA Sequenzierung Grundprinzip Sanger StudySmarterAbbildung 1: Grundprinzip der Sanger-Sequenzierung

    Bei den grauen Basenpaaren handelt es sich um einen Primer, der vom Enzym benötigt wird, sodass es einen Anfang zum Arbeiten hat – Mehr dazu erfährst Du im Abschnitt Anlagerung der Primer (Schritt 2 des Ablaufs).

    Diese DNA-Stränge können dann mithilfe einer Gelelektrophorese nach ihrer Länge geordnet werden, wodurch über einen Umweg die Basenabfolge ermittelt wird.

    Was genau eine Gelelektrophorese ist, kannst Du im gleichnamigen Artikel lernen. Wie über die Gelelektrophorese letztlich die Basenabfolge ermittelt werden kann, erfährst Du im Abschnitt Auswertung der Sanger-Sequenzierung.

    Sanger Sequenzierung – Ablauf

    Im folgenden Abschnitt erfährst du, welche Ausgangsstoffe benötigt werden, wie die unterschiedlich langen DNA-Fragmente generiert werden und wie sie genutzt werden, um die DNA zu entschlüsseln.

    Sanger Sequenzierung – Ausgangsstoffe

    Für die Sequenzierung der DNA nach Sanger werden bestimmte Ausgangsstoffe benötigt. Dazu gehören:

    • zu untersuchende DNA als Einzelstrang, genannt: Matrize
    • Primer
    • DNA-Polymerase
    • Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTP)
      • es werden vier verschiedene Arten benötigt (Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin), welche an die Matrize binden
    • Didesoxyribonucleotidtriphosphate (ddNTP)
      • hierbei fehlt eine OH-Gruppe an 3' Position - sie sorgen für den Abbruch einer Replikation und werden auch Abbruchnukleotide genannt
      • es werden ebenfalls vier verschiedene Arten benötigt (Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin)

    Schritt 1: Denaturierung

    Da DNA normalerweise nicht als Einzelstrang, sondern als Doppelstrang vorkommt, muss dieser zuerst über eine Denaturierung aufgetrennt werden.

    Durch eine Erhitzung der DNA auf etwa 90 °C für eine Minute werden die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren zerstört und die beiden Doppelstränge so voneinander getrennt. Einer der beiden Stränge wird nun als Matrize verwendet, mit dem weiter fortgefahren wird.

    Sanger-Sequenzierung DNA Sequenzierung Auftrennung Doppelstrang Einzelstrang StudySmarterAbbildung 2: Auftrennung der DNA in Einzelstränge

    Für eine Sequenzierung werden deutlich mehr Matrizen, als nur eine einzige benötigt. Es gibt einen weiteren Zwischenschritt, bei dem die Matrize schnell und einfach vervielfacht wird. Dies geschieht über die Polymerase Kettenreaktion, kurz PCR.

    Wenn dich interessiert, wie das funktioniert, dann schau doch mal beim Artikel Polymerase Kettenreaktion vorbei.

    Schritt 2: Anlagerung der Primer

    Wie bereits erwähnt, ist für den folgenden Prozess ein bekannter "Anfang" notwendig. Der Anfang, hier genannt Primer, besteht aus wenigen Nukleotiden, die komplementär zum Matrizenstrang sind.

    Für die zu untersuchende DNA muss also ein spezifischer Primer hergestellt werden. Dafür muss ein kleiner Abschnitt der DNA bereits entschlüsselt sein, da sonst kein passender Primer erstellt werden kann.

    Sanger-Sequenzierung DNA Sequenzierung Anlagerung Primer StudySmarterAbbildung 3: Anlagerung des Primers

    Der passende Primer bindet an die bestimmte Stelle am Matrizenstrang und erfüllt so die Bedingung, die von der DNA-Polymerase benötigt wird. Dies benötigt nur eine Zeit von etwa 3-6 Sekunden.

    Schritt 3: Generierung der DNA-Fragmente

    Die Herstellung der DNA-Fragmente erfolgt durch zwei Teilschritte. Dazu werden folgende Stoffe benötigt:

    • Matrizen mit angelagerten Primern
    • Nucleotide (mit den verschiedenen DNA-Basen)
      • in Form von dNTP und ddNTP
    • DNA-Polymerase
      • Enzym, dass die DNA aus Nucleotiden synthetisiert – sie setzt komplementäre Nucleotide an die Matrize, benötigt dabei aber einen kleinen Anfang, um mit der Synthese beginnen zu können

    Herstellung der Reaktionsmedien

    Die DNA beinhaltet die vier Basen Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin. Sie kommen in der DNA als Teil von Nucleotiden vor.

    Nucleotide bestehen aus einem Basen-, einem Zucker- und einem Phosphatanteil.

    Damit ein komplementärer Strang zur Matrize synthetisiert werden kann, müssen also Nucleotide mit den vier verschiedenen DNA-Basen gegeben sein.

    Um die vier Basen später voneinander unterscheiden zu können, werden parallel vier identische Reaktionsmedien hergestellt. Diese beinhalten Matrizen, Primer und dNTPs (aller vier Arten).

    Hinzu kommen Abbruchnucleotide (ddNTPs), welche die Synthese des komplementären Stranges stoppen. Der Unterschied zwischen den vier Reaktionsmedien ist, dass jedes Medium eine andere Art ddNTP enthält.

    Ein Gefäß enthält Adenin-ddNTPs (ddATP), eins Thymin-ddNTPs (ddTTP), das nächste Guanin-ddNTPs (ddGTP) und das letzte Gefäß enthält Cytosin-ddNTPs (ddCTP) im Reaktionsmedium.

    So wird in einem Gefäß beispielsweise nur nach Cytosin abgebrochen, da dort lediglich Cytosin-ddNTPs vorhanden sind. Das letzte Nucleotid des DNA-Stranges aus diesem Gefäß ist also immer Cytosin.

    Synthese der DNA-Fragmente

    Die Synthese der komplementären DNA-Stränge geschieht durch die DNA-Polymerase. Diese kann nun durch den angebundenen Primer mit ihrer Arbeit anfangen.

    Wie bei der DNA-Replikation setzt die DNA-Polymerase komplementäre DNA-Nucleotide an die Matrize, beginnend am Primer. Der neue DNA-Strang wird immer länger, bis die DNA-Polymerase durch Zufall ein Abbruchnucleotid bindet.

    Sanger-Sequenzierung DNA Sequenzierung Synthese DNA-Fragmente DNA-Polymerase StudySmarterAbbildung 4: Synthese der DNA-FragmenteQuelle: StudySmarter

    Die DNA-Synthese wird abgebrochen. So entstehen mit der Zeit viele unterschiedlich lange DNA-Fragmente, da es Zufall ist, wann bzw. an welcher Stelle ein ddNTP angelagert wird. Die DNA-Fragmente in einem Gefäß enden dabei immer an der gleichen Base, da die bestimmten ddNTPs nur zu einer anderen Base komplementär sind.

    Sanger-Sequenzierung DNA Sequenzierung DNA-Fragmente Ergebnis StudySmarterAbbildung 5: Synthetisierte DNA-Fragmente der verschiedenen Reaktionsgefäße

    Am Ende müssen die DNA-Doppelstränge erneut erhitzt werden, um die synthetisierten DNA-Fragmente von den Matrizen zu trennen.

    Nun sind alle Stoffe, die zur Entschlüsselung der DNA erforderlich sind, gewonnen. Wie aus den einzelnen DNA-Fragmenten die Basenabfolge in korrekter Reihenfolge abgelesen werden kann, erfährst Du in der Auswertung.

    Sanger Sequenzierung – Auswertung

    Zur Auswertung der gewonnenen DNA-Fragmente wird eine Gelelektrophorese durchgeführt.

    Die Gelelektrophorese ist ein biochemisches Trennverfahren mit dem z.B. DNA-Stücke unterschiedlicher Länge aufgetrennt werden können.

    Sie werden auf ein Trägermaterial (meist handelt es sich dabei um ein Agarose-Gel) gegeben auf dem eine elektrische Spannung angelegt wurde.

    Sanger-Sequenzierung DNA Sequenzierung Gelelektrophorese StudySmarterAbbildung 6: GelelektrophoreseQuelle: lerninhalte.blogspot.com

    Da das DNA-Molekül wegen der Phosphatgruppe leicht negativ geladen ist, wandert es im elektrischen Feld langsam zur Anode (Plus-Pol).

    Dabei ist die Zeit, welche die verschiedenen DNA-Fragmente dafür benötigen, unterschiedlich. Je nach Länge des Fragments werden in einer bestimmten Zeit verschiedene Wegstrecken zurückgelegt, denn große Stücke kommen nur langsam durch das Trägermaterial hindurch.

    So werden die DNA-Fragmente aufgefächert und nach ihrer Länge geordnet.

    Näheres über diese Trennmethode kannst du im Artikel Gelelektrophorese erfahren!

    Mithilfe dieses Trennverfahrens ist es möglich, die DNA-Fragmente ihrer Länge nachzuordnen, wodurch die Abbruchnucleotide in der richtigen Reihenfolge die komplementäre Basenabfolge der Matrize wiedergeben.

    Das funktioniert durch die Trennung der verschiedenen Arten der ddNTPs in vier Gefäße. So kann die Basenart am Ende des Fragments abgelesen werden. Da die Fragmente ihrer Länge nach aufgefächert wurden, ist es möglich, die Basenabfolge in der richtigen Reihenfolge lückenlos abzulesen.

    Sanger-Sequenzierung DNA Sequenzierung Gelelektrophorese der DNA-Fragmente AuswertungStudySmarterAbbildung 7: Gelelektrophorese der synthetisierten DNA-Fragmente

    Es ist inzwischen möglich, die Abbruchnucleotide mit fluoreszenten Farbstoffen zu markieren – So ist es nicht mehr nötig, vier verschiedene Reaktionsgefäße anzusetzen. Die Unterscheidung der vier Basen geschieht dann über die unterschiedliche Farbe.

    Die nun ermittelte Basenabfolge ist komplementär zur Matrize. So kann auf die Basenabfolge der Matrize geschlossen werden. Die DNA ist somit erfolgreich sequenziert worden.

    Sanger Sequenzierung – Anwendung

    Die Sequenzierung der DNA ist in vielen Anwendungsbereichen von großer Bedeutung. In der medizinischen Diagnostik können so z.B. Erbkrankheiten erkannt werden, wodurch so früh wie möglich die passendste Therapie begonnen werden kann.

    In der Abstammungsforschung können durch DNA-Sequenzierungen verschiedener Organismen bzw. Arten und deren Vergleich nähere Aussagen zu Verwandtschaftsbeziehungen getroffen werden. Dies dient unter anderem der Erstellung von Stammbäumen.

    Dabei kommt jedoch nur selten die Sanger-Sequenzierung zum Einsatz, da sie im Vergleich zu moderneren Verfahren sehr aufwendig ist und viel Zeit in Anspruch nimmt.

    Die Sanger-Sequenzierung benötigt viel Zeit, da die Bindung der Abbruchnucleotide bei der Generierung der DNA-Fragmente zufällig verläuft. Das heißt, es kann passieren, dass die DNA-Synthese an einer Stelle bereits 100-mal abgebrochen ist, an einer anderen aber noch kein einziges Mal.

    Es müssen viele Zyklen durchgeführt werden, bis an jeder Base mindestens einmal ein Abbruchnucleotid gebunden wurde.

    Weitaus effizienter und schneller sind Verfahren des Next Generation Sequencing, mit denen ganze Genome in nur wenigen Tagen sequenziert werden können. Zu diesen Verfahren zählen z.B. die Pyrosequenzierung, die Halbleitersequenzierung und die Nanoporen-Sequenzierung.

    Sanger Sequenzierung – Das Wichtigste

    • Die Sanger-Sequenzierung ist eine Methode der DNA-Sequenzierung, die über eine enzymatische Reaktion und eine anschließende Gelelektrophorese abläuft
    • Sie gehört zu den klassischen Sequenzierungsmethoden und ist langsamer als modernere Verfahren
    • Grundprinzip ist die Generierung unterschiedlich langer DNA-Fragmente, die anschließend der Länge nach geordnet werden - dabei ist die Base am Ende bekannt wodurch die Basenabfolge über die vielen Fragmente lückenlos ablesbar ist
    • Die Sequenzierung läuft in vier Schritten ab: Denaturierung, Anlagerung der Primer, Generierung der DNA-Fragmente und Auswertung über eine Gelelektrophorese
    • Anwendung findet die Sequenzierungsmethode in der medizinischen Diagnostik und der Abstammungsforschung
    Häufig gestellte Fragen zum Thema Sanger Sequenzierung

    Wie funktioniert die DNA Sequenzierung? 

    Die DNA-Sequenzierung funktioniert je nach Wahl des Verfahrens auf unterschiedliche Weise. Die Sanger-Sequenzierung funktioniert über eine enzymatische Reaktion - Die Synthese von DNA-Fragmenten mithilfe der DNA-Polymerase. Diese Fragmente können anschließend über eine Gelelektrophorese geordnet und abgelesen werden.

    Wie lange dauert eine DNA Sequenzierung? 

    Eine DNA-Sequenzierung nach Sanger kann mehrere Tage bis Wochen in Anspruch nehmen. Modernere Verfahren hingegen sind schneller und effizienter - Diese benötigen nur wenige Tage um ein gesamtes Genom zu entschlüsseln. Prinzipiell ist die Dauer abhängig von der Größe des Genoms.

    Welches Ziel hat die Sequenzierung? 

    Das Ziel einer Sequenzierung ist die Entschlüsselung der DNA, d.h. die Bestimmung der Basenabfolge.

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