Die Reverse Transkriptase wird in der Gentechnik verwendet und stammt ursprünglich aus RNA-Viren. Der Name "Reverse Transkriptase" stammt daher, dass das Enzym in der Lage ist die umgekehrte Reaktion der Transkription durchzuführen.
Reverse Transkriptase – Entdeckung
Im Jahre 1970 wurde die Reverse Transkriptase entdeckt. Dies geschah zufälligerweise gleichzeitig durch zwei Wissenschaftler, die unabhängig voneinander arbeiteten. Dafür bekamen beide, die US-Amerikaner David Baltimore und Howard Temin, den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin im Jahre 1975.
Reverse Transkriptase – Erklärung
Die Reverse Transkriptase ist ein Enzym, welches in der Gentechnik eingesetzt wird und RNA in DNA umwandeln kann.
Wie schon oben erwähnt, gehört die Reverse Transkriptase (kurz RT) zu der Klasse der Enzyme. Im Allgemeinen sind Enzyme sogenannte Biokatalysatoren. Das bedeutet, dass chemische Reaktionen mit ihrer Hilfe schneller ablaufen können. Dabei wird aber das Reaktionsgleichgewicht der beteiligten Stoffe nicht verändert. Zudem werden Enzyme bei diesen Reaktionen nicht verbraucht. Dementsprechend wird auch die Reverse Transkriptase bei ihrer Arbeit ebenfalls nicht verbraucht.
Dass das Reaktionsgleichgewicht bei Enzymreaktionen unverändert bleibt, bedeutet, dass die Reaktion durch das Enzym schneller abläuft. Trotzdem ändert sich aber nicht die Menge an Substrat und Produkt, die durch die Reaktion gebildet werden würde.
Reversen Transkriptase – Funktion
Die Reverse Transkriptase sorgt dafür, dass RNA in DNA umgeschrieben wird. Dabei wird zunächst ein RNA-DNA-Hybridstrang synthetisiert. Im Anschluss wird der RNA-Anteil entfernt. Zum Schluss erfolgt die Replikation zum DNA Doppelstrang. Dies passiert normalerweise meist in Viren, kann aber auch in der Gentechnik und Molekularbiologie genutzt werden.
RNA- und DNA-Polymerasen unterscheiden sich insofern, als bei den DNA-Polymerasen ein DNA-Doppelstrang bei der Replikation entsteht. Wohingegen bei der RNA-Polymerase nur ein einsträngiger RNA oder DNA-Strang entsteht.
Reverse Transkription
Die Hauptfunktion der Reverse Transkriptase ist die Reverse Transkription. Diese kann in mehrere Schritte unterteilt werden.
Zunächst gibt es eine Ausgangs RNA, welche in eine DNA umgewandelt werden soll.
Die spezifischen Primer setzen sich an die RNA und danach kann die Reverse Transkriptase andocken.
Die Reverse Transkriptase läuft an der RNA entlang und bildet einen komplementären cDNA Strang.
Dadurch entsteht ein RNA-DNA-Hybrid-Doppelstrang.
RNAsen bauen nun die RNA ab, die cDNA bleibt erhalten.
DNA Polymerasen können jetzt (durch einen Primer) an diesen cDNA Strang andocken und den komplementären Strang ergänzen.
Das Ergebnis ist ein DNA Doppelstrang
Reverse Transkription bei Viren
Retroviren benötigen die Reverse Transkriptase. Sie enthalten nämlich lediglich RNA, benötigen aber DNA, um die gewünschte Zelle zu befallen. Der Ablauf dieses Virenangriffs von Retroviren ist folgender Abbildung 1 (am Beispiel HIV) dargestellt.
Abbildung 1: Vermehrung eines Retrovirus. Quelle: wikipedia.de
- Zu Beginn gibt das Virus seine RNA in die Zielzelle ab.
- Die Reverse Transkriptase schreibt indessen die RNA in DNA (ähnlich wie oben beschrieben) um.
- Durch das Enzym Integrase werden diese VirenDNA soeben in den Zellkern befördert.
- Dadurch, wird diese DNA von den zelleigenen Organellen abgelesen (transkribiert).
- Es werden Virus-Bauteile und neue Virus RNA synthetisiert.
- Wenn genug Organellen gebildet wurden, können sich diese zu neuen Viren zusammenschließen.
- Diese neuen Retroviren verlassen die befallene Zelle und beginnen damit, weitere Zellen zu befallen.
Reverse Transkriptase – Vorkommen
Das Enzym Reverse Transkriptase kommt unterschiedlichsten Organismen vor. Einige kannst du der Tabelle entnehmen:
| Form der Reverse Transkriptase | Organismus |
HIV-1 Reverse Transkriptase | HI-Virus Typ 1 |
M-MLV Reverse Transkriptase | Murines Leukämievirus |
Telomerase Reverse Transkriptase | Menschliche embryonale Zellen |
Die Reverse Transkriptase kommt häufig in Retroviren vor. Ein Beispiel für ein Retrovirus wäre HIV. Das Retrovirus muss erst seine RNA in DNA umschreiben, bevor es die Wirtszelle damit befallen kann. In der Wirtszelle entfaltet es seine onkogene Wirkung, ist also krebsauslösend.
Telomerase Reverse Transkriptase
Die Telomerase RT kommt im menschlichen Körper nur in embryonalen Zellen, also Zellen der Keimbahn vor. Dabei ist sie zuständig für die Herstellung von Telomeren. Diese gehen bei der Zellteilung verloren.
Telomere sind die Enden der Chromosomen, die nicht codierend sind. Sie sind einzelsträngig und haben eine Stabilitätsfunktion in der DNA.
Momentan wird an der Verteilung der Telomerase Reverse Transkriptase in den Zellen geforscht. Genauer gesagt wird geschaut, welche Rückschlüsse man damit auf die Alterung der Zelle und mit dem Altern assoziierte Krankheiten ziehen kann. Die Telomerase synthetisiert DNA, wenn eine RNA als Vorlage vorhanden ist. Zu dieser Art gehört auch die Reverse Transkriptase.
Hemmung der Reversen Transkriptase
Für die meisten Stoffe und Enzyme im menschlichen Körper gibt es auch Hemmstoffe, sogenannte Antagonisten (Gegenspieler). Bei Retroviren, wie beispielsweise HIV, kann eine Hemmung der Reversen Transkriptase wichtig sein. Dadurch, dass die RT gehemmt wird, kann sich das Retrovirus weniger schnell vermehren. Weil aber die Reverse Transkriptase eine vergleichsweise hohe Mutationsrate besitzt, ist die Entwicklung eines Hemmstoffes zur Therapie von HIV infizierten Menschen relativ schwierig.
Reverse Transkriptase – Gentechnik
Größtenteils wird die Reverse Transkriptase in der Gentechnik bei der PCR, also der Polymerase Kettenreaktion eingesetzt. Genauer gesagt bei der Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, kurz RT-PCR.
Die PCR ist eine Vorgehensweise, welche zur Vervielfältigung der DNA dient.
Funktion der RT-PCR
Bei der RT-PCR werden zwei gentechnische Methoden miteinander kombiniert. Einerseits die RT-Reaktion und zum anderen die PCR. Die RT-PCR wird in der Diagnostik verwendet, denn durch diese Reaktion kann RNA nachgewiesen werden oder auch RNA Viren. Der Begriff RT-PCR wird teilweise auch mit Realtime PCR übersetzt. Dafür wird diese Methode überwiegend mit qPCR abgekürzt, um Verwechslungen zu vermeiden.
Durch diese Methode lassen sich sowohl HIV Viren, als auch das neuartige Coronavirus (SARS-CoV-2) nachweisen.
Dabei gehen Wissenschaftler*innen bei der RT-PCR in dieser Reihenfolge vor:
- Die Isolierung der gesamt RNA / mRNA
- Die Umschreibung in komplementäre cDNA
- Danach folgt die PCR
Wie genau diese Schritte ablaufen, lernst du nun im Detail.
Isolierung der RNA
Im ersten Schritt werden Stücke von Geweben oder Zellen lysiert, also die Zellmembran aufgelöst. Danach werden diese Bruchstücke durch Silica-Säulen zentrifugiert. Die Stücke, die an der Silica Membran gebunden sind, stellen die gesamte RNA dar.
Bei der Silica-Säulen Zentrifugation reicht es sich zu merken, dass durch dieses Verfahren dir RNA von anderen Zellbestandteilen getrennt werden kann. Dabei werden diese ausgewählten Stoffe durch Zentrifugalkraft in der Säule gehalten.
Die Umschreibung
Die vorhandene gesamte RNA muss jetzt in DNA übersetzt werden. Dabei kommt unsere Reverse Transkriptase zum Einsatz. Zuerst wird die gesamt RNA mit Primern markiert, damit daran die Reverse Transkriptase arbeiten kann.
Das Enzym benötigt, wie oben erwähnt, sogenannte Primer. Dies sind kurze Nukleotidketten, welche komplementär zum abzulesenden DNA-Strang sind. Das Enzym benötigt Primer, an welche es an die DNA andocken kann. Die Reverse Transkriptase kann also nur arbeiten, wenn sie an so einen Primer andocken kann.
Die Reverse Transkriptase schreibt jetzt die gesamt RNA in cDNA um. Das ist wichtig, weil diese als Matrize (Vorlage) für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) gilt.
Die verwendete Reverse Transkriptase wird dabei meist aus Retroviren gewonnen.
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Zuletzt wird eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Dies siehst du in Abbildung 2 dargestellt. Dabei können Zielgen Primer an die cDNA andocken, die fluoreszenzmarkiert sind. Dadurch kann eine realtime-PCR ablaufen. Das bedeutet, dass die Primer nur andocken und fluoreszieren, wenn die cDNA das gewünschte Zielgen enthält. Die Fluoreszenz ist direkt sichtbar. Wenn also eine Fluoreszenz auftritt, ist das Zielgen in der Probe vorhanden.
Primer sind in der Biologie kleine DNA Stücke, die häufig bei der PCR verwendet werden. Sie sind komplementäre Stücke für spezielle Abschnitte der zu untersuchenden DNA.
Abbildung 2: Ablauf der RT-PCR.Quelle: sawakinome.comReverse Transkriptase - Das Wichtigste
- Die Reverse Transkriptase ist ein Enzym.
- Sie katalysiert die Umwandlung von RNA in DNA.
- Die Reverse Transkriptase ist in Retroviren von großer Bedeutung.
- Die Reverse Transkriptase kann für die Gentechnik nützlich sein, z. B. im Rahmen der RT-PCR.
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