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Die Gelelektrophorese ist eine Sonderform der Elektrophorese. Bei dieser Sonderform wandern bestimmte Teilchen in einem gerichteten Feld von einer zur anderen Seite. Das besondere bei der Gelelektrophorese ist das Gel. Es fungiert als eine Art Sieb, welche von kleinen Molekülen schneller durchwandert werden kann. Große sperrige Moleküle hingegen wandern langsamer durch das Gel. Somit können die Stoffe nach ihrer Größe aufgetrennt werden.
Elektrophorese – Grundlage
Bei der Elektrophorese spielen sowohl chemische als auch physikalische Grundlagen eine wichtige Rolle.
Chemische Grundlage der Elektrophorese
Wie bereits erwähnt, werden bei der Gelelektrophorese Molekülgemische anhand ihrer Größe und Ladung aufgetrennt. Das elektrische Feld wird durch zwei Elektroden erzeugt. Die Ladung der Elektroden gibt im Zusammenspiel mit der Ladung der zu trennenden Teilchen deren Laufrichtung vor. Eine wichtige Voraussetzung ist also, dass die Moleküle geladen sein müssen. Die Ladung definiert, in welche Richtung sich die Moleküle bewegen.
Wichtig zu erwähnen ist hier, dass die Moleküle durch das elektrische Feld von der einen negativ geladenen Elektrode (Kathode) zur anderen positiv geladenen Elektrode (Anode) wandern. Dabei sind sowohl Proteine als auch das Erbgut negativ geladen, weswegen sie sich zu dieser positiv geladenen Kathode hin orientieren.
Physikalische Grundlage der Elektrophorese
Die Teilchen bei der Elektrophorese wandern nicht zufällig, sondern nach ganz bestimmten physikalischen Eigenschaften. Dabei ist die Wandergeschwindigkeit (V) der Moleküle proportional zur Feldstärke (E) und zur Ionenladung (Q).
Die elektrische Feldstärke (E) ist ein Maß für die Intensität, die ein elektrisches Feld besitzt.
Außerdem ist die Wanderungsgeschwindigkeit (V) der Moleküle abhängig vom Radius des Teilchens (r) und der Viskosität des Stoffes (η). Wenn der Radius (r) groß ist, bedingt das eine langsamere Wanderung des Moleküls in der Elektrophorese.
Die Wanderungsgeschwindigkeit kann also im Zusammenspiel der oben genannten Faktoren als diese Formel ausgedrückt werden:
Bei dieser Formel wird die idealisierte Größe eines Teilchens einbezogen, dessen Formel ist:
Zusammenspiel der naturwissenschaftlichen Grundlagen bei der Gelelektrophorese
Wenn die naturwissenschaftlichen Grundlagen ineinander greifen, zeigt sich die Funktion der Elektrophorese. Sie dient der Trennung von Stoffgemischen. Dies geschieht nach nach der elektrophoretischen Mobilität.
Die elektrophoretische Mobilität ist eine Angabe darüber, wie gut und schnell der Stoff durch das elektrische Feld wandern kann.
Grundlagen der Elektrophorese
Die hier genannten Funktionsprinzipien bilden die Grundlage der Gelelektrophorese. Die Elektrophorese ist definiert als Wanderung von geladenen Teilchen und Molekülen durch ein elektrisches Feld. Es wird also zunächst ein elektrisches Feld gebraucht.Zudem braucht es Teilchen, die unterschiedlich schnell wandern. Dies tun sie aufgrund ihrer Größe und ihrer Ladung. Als Letztes wird für die Elektrophorese eine Art Sieb zur Auftrennung während der Wanderung der Teilchen benötigt. Bei der Gelelektrophorese handelt es sich um eine spezielle Form der Elektrophorese, bei welcher die aufzutrennenden Moleküle durch ein Gel, welches als Sieb dient, wandern.
Gelektrophorese – Ablauf
Die Gelelektrophorese ist eine Art der Elektrophorese. Dabei wird diese Methode häufig in der Molekularbiologie und der Chemie zur Trennung von Stoffen verwendet.
Prinzip Gelelektrophorese
Wie bei jeder Form der Elektrophorese, wandern auch bei der Gelelektrophorese die Moleküle durch ein elektrisches Feld. Die Wanderung der negativen Teilchen (Anionen) erfolgt dabei zur positiven Anode. Die positiv geladenen Teilchen (Kationen) wandern hingegen zur negativ geladenen Kathode.
Es wird anfangs eine Pufferlösung und das Gel in die Gelelektrophorese Apparatur gegeben. Die Pufferlösung enthält geladene Teilchen (Ionen), welche die Leitfähigkeit gegenüber Wasser erhöhen und den Widerstand reduzieren. Die Teilchen wandern nun durch ein Gel. Dies gibt der Gelelektrophorese auch ihren Namen. Das Gel weist Poren auf, wodurch es als Sieb fungiert. Große Moleküle wandern entsprechend bei der Gelelektrophorese langsamer durch das Gel als kleine.
Kleinere Moleküle durchwandern aufgrund ihrer Größe das Gel schneller als große Moleküle, die durch die kleinen Poren des Gels bei ihrer Wanderung behindert werden.
Gelelektrophorese – Gel
Die Gele für die Gelelektrophorese fungieren als Netz oder Sieb der Moleküle, die durch sie hindurch wandern. Da die Gelelektrophorese bei vielen verschiedenen Arten von Molekülen angewandt wird, müssen Gele mit unterschiedlich großen Maschen eingesetzt werden. Die zwei gängigsten Gele lernst Du im nächsten Absatz kennen.
Agarose Gelelektrophorese
Das Agarosegel gilt als eines der am häufigsten eingesetzten Gele bei der Gelelektrophorese. Es ist im Gegensatz zum anderen Gel, welches Du in diesem Artikel kennenlernst, relativ weitmaschig. Dies kann zumindest über die normale Agarose Gelelektrophorese mit einer Agarose Konzentration von 1% behauptet werden. Das bedeutet, dass es eher für die Auftrennung von großen Molekülen im Rahmen der Gelelektrophorese zum Einsatz kommt.
Andere Varianten werden bei der speziellen SDS-PAGE weiter unten im Artikel beschrieben. Ein Beispiel für den Einsatz der Agarose wäre die Gelelektrophorese von DNA.
Agarose ist der Hauptbestandteil des aus Algen gewonnenen Agars. Das hast Du vielleicht schon einmal gehört, da Agar (oder Agar Agar) oft von Vegetarier*innen als Ersatz für Gelatine verwendet wird.
Polyacrylamid Gelelektrophorese
Eine weitere verbreitete Methode zur elektrophoretischen Auftrennung von Molekülen ist die Polyacrylamid-Gelelektrophorese, kurz PAGE. Im Vergleich zur Agarose hat das Polyacrylamid Gel engere Maschen. Das bedeutet, dass es für die Gelelektrophorese kleinerer Moleküle verwendet werden kann. Dabei kann die Maschenweite durch die Konzentration von Acrylamid im Gel angepasst werden.
Ein Beispiel für den Einsatz von Polyacrylamid Gel wäre die Auftrennung und Sortierung verschiedenster Proteine eines Proteingemischs.
Gelelektrophorese – Anwendung
Wie bereits angedeutet, wird die Gelelektrophorese in der Molekularbiologie und Biochemie als gängiges Verfahren angewandt.
Anwendungsbereiche der Agarose Gelelektrophorese
Im Labor wird DNA und RNA durch die Gelelektrophorese mit Agarose aufgetrennt. Zudem können durch die großporige Agarose große Proteine im Labor die Gelelektrophorese durchlaufen.
Die Gelelektrophorese kann bei einem Vaterschaftstest oder bei der Polizei verwendet werden, um verschiedene DNA Proben miteinander zu vergleichen. Beispielsweise um herauszufinden, um die von der Spurensicherung sichergestellten DNA-Proben (z. B. auf Tatwaffen) mit denen der jeweiligen verdächtigen Person übereinstimmen. Die Gelektrophorese kann also bei der Überführung der potentiellen Täter helfen.
Anwendungsbereiche der Polyacrylamid Gelelektrophorese
Auch die Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist eine häufig angewendete Methode. Bei dieser SDS PAGE findet eine Auftrennung von Proteinen durch die Gelelektrophorese statt. SDS steht dabei für "sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis". Diese Methode findet beispielsweise Anwendung bei dem Nachweis von HIV oder bei der Diagnostik von Nierenerkrankungen auftreten kann.
SDS ist ein Stoff, welcher sich an die aufgetrennten Proteine anlagert. Dadurch lagert sich SDS so an, dass die Ladungen am Protein gleich sind. Nur wenn die Proteine größer sind, lagert sich entsprechend mehr SDS an. Die Proteine erhalten durch SDS eine negative Ladung, die proportional zu ihrer Länge ist.
Gelelektrophorese – Auswertung
Durch die Gelelektrophorese wurden die Moleküle ihrer Größe nach aufgetrennt. Die Auswertung des Ergebnisses und damit die Sichtbarmachung kann in mehreren Varianten erfolgen. Dabei werden die Proben, also beispielsweise die DNA oder Proteine im Gel sichtbar gemacht.
Bei der Auftrennung der Proteine ist meist ein Größenstandard vorhanden. Bei der DNA Auftrennung beispielsweise besteht dieser aus verschiedenen bekannten DNA Fragmentgrößen, welche sich durch die Gelelektrophorese in Banden anlagern. Dadurch kann auf die Fragmentgröße der zu untersuchenden DNA geschlossen werden.
Die Auswertung einer Agarose Gelelektrophorese
Um das Ergebnis von DNA bei der Gelelektrophorese sichtbar zu machen, kann diese vorher radioaktiv markiert werden. Dazu setzt man radioaktive Isotope ein. Die Strahlung, die von diesen ausgeht, führt zur Schwärzung eines Filmes, welcher über das Gel gelegt wird (Autoradiogramm) oder kann einfach gemessen werden. Eine weitere Möglichkeit für die Sichtbarmachung der DNA wäre die Färbung dieser. Die Färbung der DNA kann beispielsweise mit dem Stoff Ethidiumbromid erfolgen. Sichtbar wird das Ergebnis der Gelelektrophorese dann unter UV-Licht.
Ethidiumbromid, auch als EtBr abgekürzt, ist ein rot erscheinender Farbstoff, verwendet um das DNA Bandenmuster nach der Gelelektrophorese sichtbar zu machen. Das EtBr ändert seine Absorption (interkaliert), wenn es sich mit DNA verbindet. Dadurch erschienen diese Stellen als helle Banden unter UV-Licht. Beim Umgang mit Ethidiumbroimid ist Vorsicht geboten, da es als krebsverdächtiger Arbeitsstoff eingestuft wurde. Deswegen sollten beim Umgang mit EtBr Handschuhe, möglichst aus Nitril, getragen werden.
Abbildung 2: Gelelektrophorese von DNA mit EthidiumbromidAnwendung von Richtbanden bei der Auswertung der Gelelektrophorese
Im Labor kann es auch dazu kommen, dass eine Richtbande eingesetzt wird, um die anderen Banden vergleichen zu können. Dabei ist der Molekulargewichtsstandard der Richtbande und ihre Wandergeschwindigkeit (V) bekannt. Banden entstehen, wenn sich viele gleich große Moleküle an einer Stelle im Gel sammeln, da sie gleich schnell wandern.
Der Molekulargewichtsstandard ist ein Gemisch, bei welchem die Größe bekannt ist. Bei der Gelelektrophorese kann dann abgeschätzt werden, welche Größe der zu untersuchende Stoff im Gegensatz zum diesem Standard verhältnismäßig haben muss.
Die Auswertung einer SDS-PAGE
Eine SDS-Page kommt nur bei manchen Stoffen zum Einsatz. Sie sorgt dafür, dass die Ladung der Stoffe irrelevant wird. Die beeinflusst Ladung beeinflusst nicht die Wandergeschwindigkeit der Moleküle und somit können diese nur nach der Größe geordnet werden.
Anfärbung der Proteine
Auch Proteine kann man nach der Gelelektrophorese sichtbar machen und damit ein Ergebnis erhalten. Dabei ist eine Möglichkeit, sie zu färben.
Ein Beispiel für die Anfärbung von Proteinen ist die Silberfärbung oder noch geläufiger ist die Färbung mit Coomassie. Dies geschieht mit einem Coomassie-Brilliant-Blau Farbstoff, womit die Proteine nach der Gelelektrophorese gefärbt und so sichtbar gemacht werden können.
Immunologischer Nachweis der Proteine
Zudem können Proteine immunologisch nachgewiesen werden. Dies geschieht beim Western Blot. Hierbei werden die Proteine auf eine Trägermembran übertragen. Die Proteine können unterschiedliche Reaktionen auf die immunologische Trägermembran zeigen und dadurch nachgewiesen werden.
Bei der Trägermembran des Western Blots handelt es sich um eine Membran, die mir den passenden Antikörpern der Proteine versehen sind, welche nachgewiesen werden sollen. Nur wenn diese vorhanden sind findet also eine immunologische Reaktion statt.
Gelelektrophorese – Das Wichtigste
- Die Gelelektrophorese wird in der Biochemie und Molekularbiologie beispielsweise als Werkzeug der Analyse von DNA verwendet.
- Bei der Gelelektrophorese werden Moleküle in einem Gel gefiltert.
- Das Gel wird als Netz verwendet, sodass große Moleküle langsamer wandern als kleine Moleküle.
- Durch die Gelelektrophorese können Proteine und DNA analysiert werden.
Nachweise
- Abb. 2: Gel electrophoresis (https://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Gel_electrophoresis_2.jpg) von Mnolf (https://commons.wikimedia.org/wiki/User:Mnolf) lizenz nach CC BY-SA 3.0
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Häufig gestellte Fragen zum Thema Gelelektrophorese
Was ist das Bandenmuster?
Unter dem Bandenmuster der Gelelektrophorese versteht man Bereiche im Gel, in denen sich die Teilchen ansammeln. Dadurch, dass gleiche Teilchen durch das Gel gleich schnell wandern, bilden sie ein Muster, sogenannte Banden.
Warum wandern längere DNA Fragmente langsamer als kurze?
Durch das Gel, welches wie ein Netz fungiert, können kleine Moleküle schneller wandern. Große DNA Fragmente hingegen bleiben häufiger hängen und wandern deswegen langsamer.
Warum gibt es einen Puffer bei Gelelektrophorese?
Durch die Pufferlösung wird die Leitfähigkeit erhöhen. Dadurch wird die Beweglichkeit der Ionen in der Lösung größer.
Was passiert bei der Gelelektrophorese?
Bei der Gelelektrophorese wandern Teilchen ihrer Ladung entsprechend durch ein Gel. Dieses fungiert als eine Art Netz, sodass kleine Teilchen schneller wandern als große. Damit kommt es zur Auftrennung der Teilchen, die anschließend analysiert werden kann.
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