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Sequenzanalyse

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Sequenzanalyse

Bei der Sequenzanalyse, auch DNA-Sequenzierung genannt, handelt es sich um ein molekularbiologisches Verfahren, bei dem die Abfolge (Sequenz) der Nukleotide (also Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin) eines DNA-Abschnitts ermittelt wird.

Die Sequenzanalyse wird sowohl in der Forschung als auch in der Medizin eingesetzt. So können mit Hilfe der DNA-Sequenzierung Mutationen in bestimmten Genen identifiziert und eine Behandlung der daraus resultierenden Krankheit eingeleitet werden. In der Forschung lassen sich aus DNA-Sequenzen beispielsweise Proteinsequenzen (Abfolge von Aminosäuren) bestimmen. So können theoretische Aussagen über die Form und Funktion des Proteins getroffen werden.

Auch große Abschnitte lassen sich sequenzieren - allerdings nicht an einem Stück. Für die Analyse ganzer Genome zum Beispiel werden diese in der Regel in kleinere Abschnitte zerlegt und anschließend am Computer wieder zusammengesetzt.

Der Teilbereich der Biologie, der sich mit der computergestützten Verarbeitung großer, biologischer Datenmengen beschäftig, nennt sich Bioinformatik.

Sequenzanalyse – Verfahren

Im Anschluss findest du einen Überblick über die wichtigsten Methoden zur Sequenzanalyse. Während ältere Verfahren v.a. basenspezifische Brüche im DNA-Strang nutzen , sucht man bei modernen Methoden nach noch effizienteren Alternativen.

Maxam-Gilbert-Methode

Im Jahre 1977 entwickelten die beiden amerikanischen Forscher Allan Maxam und Walter Gilbert eine der ersten Methoden zur DNA-Sequenzierung. Ihr Verfahren beruhte auf einer basenspezifischen, chemischen Spaltung der DNA.

Der zu untersuchende DNA-Abschnitt wurde an einem Ende radioaktiv markiert und in vier Reaktionsgefäße aufgeteilt. In jedem der Gefäße wurden andere Basen(-kombinationen) chemisch modifiziert (entweder Guanin allein, Adenin und Guanin, Cytosin oder Cytosin und Thymin).

An den Stellen in der Abfolge, an denen eine der modifizierten Basen vorkam, entstand ein Bruch im DNA-Strang. Da in jedem der vier Reaktionsgefäße andere Basen zu den Brüchen führten, ergaben sich vier charakteristische Mischungen unterschiedlich langer DNA-Stücke. Diese wurden im Anschluss vervielfältigt.

Die Proben aus den vier Reaktionsgefäßen wurden nun auf ein denaturierendes Polyacrylamid-Gel gegeben und entsprechend ihrer Größe aufgetrennt.

Der Ablauf:

Zunächst gingen ihre Untersuchungen von einer doppelsträngigen DNA aus, die auf jeder Seite des Einzelstrangs mit einem radioaktiven Primer markiert und schließlich durch Denaturierung in zwei Einzelstränge aufgetrennt wird.

Denaturierung beschreibt eine strukturelle Änderung von Biomolekülen durch äußere Einflüsse. Dazu gehört zum Beispiel die Formänderung eines Proteins durch Hitze. Das Protein verliert dadurch seine Funktion.

Die Einzelstränge werden dann in vier verschiedenen Reaktionsvorgängen mit Lösungen bestimmter Chemikalien behandelt. Diese haben die Aufgabe spezifische Nukleotide zu zerstören. Am Ende wird erreicht, dass eine der vier Basen abgespalten wird und DNA-Fragmente entstehen. Folgendes Beispiel hilft dir, dir diesen Vorgang konkreter vorzustellen:

Wenn Guanin abgespalten wird, entsteht dort eine Lücke im DNA-Strang. An den Lücken wird der DNA-Strang dann gespalten und es entstehen Fragmente verschiedener Längen. Aus einem Strang der beispielsweise drei G-Nukleotide enthält, entstehen nach Abspaltung von Guanin sechs verschieden lange Fragmente.

Zum Schluss werden mithilfe der Gelelektrophorese die DNA-Fragmente der Länge nach sortiert. Kurze Fragmente wandern hierbei weiter als lange. Nach den vier Abspaltungsvorgängen kann der Standort der einzelnen Basen abgelesen werden, da sie radioaktiv markiert sind. Sie schwärzen das Gel, welches mit einem strahlenempfindlichen Film bedeckt ist.

Sequenzanalyse Maxam-Gilbert Methode StudySmarterAbbildung 1: Maxam-Gilbert-Methode (rot: radioaktive Markierung). Quelle: wikipedia.org

Sequenzanalyse nach Sanger

Die ursprünglich von Sanger und Coulson entwickelte Sequenzanalyse wird auch als Didesoxymethode oder Kettenabbruch-Synthese bezeichnet. Sie wird häufiger angewendet, da dazu heutzutage keine gefährlichen chemischen Stoffe mehr genutzt werden.

Der Ablauf:

Zunächst wird aus der zu untersuchenden doppelsträngigen DNA eine einzelsträngige DNA erzeugt. Dafür wird die reine DNA-Probe bei 94 °C für 1 min erwärmt. Nun liegen lediglich DNA-Einzelstränge vor, an denen weitere DNA-Stränge mit unterschiedlichen Längen synthetisiert werden können.

Da die DNA aus vier unterschiedlichen Nukleotiden gebildet wird, werden vier getrennte Reaktionsansätze gestartet. In jedem Reaktionsansatz befindet sich die gleiche DNA-Polymerase und der gleiche sequenzspezifische-Primer.

Dabei bestimmt die Primersequenz den Beginn für die Synthese des neuen DNA-Strangs. Der Primer bindet an eine bereits bekannte Sequenz der DNA. Neben Primer und DNA-Polymerase befinden sich auch freie Nukleotide (dNTPs) in der Reaktionslösung, mit denen die Polyermase komplementäre DNA-Stränge bilden kann.

Als nächstes wird in jeden Ansatz je eines von vier Didesoxynukleotiden (kurz ddNTPs) hinzugefügt. Sie gleichen dem Aufbau der unmodifizierten Nukleotidbasen (dNTPs). Bei den Didesoxynukleotiden fehlt allerdings eine 3‘-OH-Gruppe, sodass kein weiteres dNTP oder ddNTP angehängt werden kann.

Zu Beginn der Verfahrensentwicklung wurden ddNTPs radioaktiv markiert, später stieg man auf gesundheitsschonendere Fluoreszenz-Farbstoffe um.

Fluoreszenz-Farbstoffe können zum Leuchten angeregt werden. Jedem Didesoxynukleotid kann so eine Farbe zugeordnet werden.

Wird ein Didesoxynukleotid eingebaut führt es dazu, dass die Strangsynthese abgebrochen wird. Deshalb hat man diesem Verfahren auch den Namen des Kettenabbruchverfahrens gegeben.

  • Eine einzelsträngige DNA wird genutzt. Ein dazu passender DNA-Strang wird synthetisiert. Ein Primer wird dazu gegeben, der den Anfangspunkt für die Synthese durch die DNA-Polymerase liefert.
  • Hinzu werden Didesoxynukleotide gefügt, die radioaktiv markiert sind. Beim Einbau dieser Didesoxynukleotide während der Synthese, kommt es zu einem Kettenabbruch.

Zum Schluss erhält man unterschiedlich lange DNA-Fragmente mit verschiedenen Enden, ähnlich wie bei der Maxam- und Gilbert- Methode. Sie werden mithilfe der Gelelektrophorese der Länge nach geordnet. Die Abbruchstellen durch die Didesoxynukleotide, sind zu erkennen, da sie durch die ddNTPs markiert sind. Anschließend werden die Informationen von einem Detektor abgelesen und der Computer berechnet aus den Daten die Basensequenz im DNA-Molekül aus. Die Informationen können dann in der Wissenschaft genutzt werden um Genome zu untersuchen.

Sequenzanalyse Sanger-Sequenzierung StudySmarterAbbildung 2: Prinzip der Sanger-Sequenzierung. Quelle: wikipedia.org

Sequenzanalyse – Moderne

Da die DNA-Sequenzanalyse ziemlich häufig in der Forschung verwendet wird, wurden im Laufe der Zeit automatisierte und effizientere Verfahren entwickelt. Diese neueren Methoden werden auch unter dem Begriff Next Generation Sequencing zusammengefasst. Eines dieser Verfahren ist die Pyrosequenzierung:

Pyrosequenzierung

Bei der Pyrosequenzierung werden Lichtsignale gemessen, die bei dem Einbau von Nukleotiden in den DNA-Strang entstehen. Genauer entsteht ein Lichtsignal, wenn Pyrophosphationen während des Einbaus des Nukleotids abgespalten werden. Das Lichtsignal wird von einem Detektor aufgefangen und in eine Basensequenz umgerechnet.

Zuerst wird das zu untersuchende DNA-Fragment über eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt. Nun werden gleich große Anteile an DNA-Fragmenten in viele einzelne Reaktionskammern gegeben, in denen die DNA an kleine Glaskugeln anheftet. Da es sich um die gleichen DNA-Fragmente handelt, wird nicht ein einzelnes Lichtsignal aus einem Einbau in einer Reaktionskammer gemessen, sondern direkt ein Vielfaches aus allen DNA-Strängen in allen Reaktionskammern.

Während der Reaktion werden kontrolliert einzelne Nukleotide in die Reaktionskammern gegeben, bis keine weiteren Lichtsignale erhalten werden. Dabei ist die freiwerdende Energie in Form von Licht direkt abhängig von abgespaltenem Pyrophosphat. So können auch aufeinander folgende Mehrfacheinbauten wahrgenommen werden. Bleiben Lichtsignale aus, wird das nächste Nukleotid hinzugegeben. Überschüssige Nukleotide werden über ein spezielles Enzym abgebaut.

Sequenzanalyse Pyrosequenzierung StudySmarterAbbildung 3: Aufbau der Pyrosequenzierung.

Sequenzanalyse – Nutzung

In der medizinischen Diagnostik wird die Sequenzanalyse genutzt um Erbkrankheiten zu erkennen und sie mit DNA-Sequenzen gesunder Patienten zu vergleichen. Das Ziel ist es die Mutation in der DNA-Sequenz zu finden, um bei Ungeborenen oder Neugeborenen eine Erbkrankheit zu detektieren und frühzeitig zu therapieren.

Ein weiterer Bereich in der Medizin ist die Erforschung von DNA-Mutationen, wie zum Beispiel bei Antibiotika Resistenzen. Die Sequenzanalyse trägt im Endeffekt dazu bei, entsprechende Medikamente entwickeln zu können.

In der Phylogenetik (Gebiet welches sich mit der Stammesgeschichte der Lebewesen beschäftigt) wird die Sequenzanalyse ebenfalls genutzt um Verwandtschaftsgrade zu untersuchen. Aus diesen Informationen können dann Stammbäume erstellt werden.

Sequenzanalyse – Das Wichtigste

  • Die Sequenzanalyse bzw. DNA-Sequenzierung beschreibt die Ermittlung der Nukleotidabfolge der DNA.
  • Bei der Methode von A. Maxam und W. Gilbert verwendeten sie eine doppelsträngige DNA, die sie in vier Schritten chemisch verschieden behandelten und einzelne Nukleotide abspalteten.
  • Die Sanger-Sequenzierung wird auch Kettenabbruchmethode genannt und verwendet Disdesoxynukleotide, die beim Einbau während der DNA-Synthese zu einem Strangbruch führen. Anhand der Abbruchstellen kann eine Basensequenz errechnet werden.
  • Ein modernes Verfahren ist die Pyrosequenzierung, bei der Nukleotidbasen kontrolliert bei der DNA-Synthese hinzugegeben werden. Bei einem Einbau entsteht ein Lichtsignal, das vom Detektor gemessen wird.
  • Die DNA-Sequenzanalyse wird in der medizinischen Diagnostik von Erbkrankheiten und der Untersuchung von DNA-Mutationen genutzt. In der Phylogenetik wird sie verwendet um Verwandtschaftsgrade zu untersuchen und anschließend Stammbäume zu erstellen.

Häufig gestellte Fragen zum Thema Sequenzanalyse

Bei der DNA-Sequenzierung kann durch die Nutzung verschiedener Methoden die Nukleotidabfolge der DNA ermittelt werden. Diese Methoden basieren auf basenspezifischer chemischer Spaltung (Maxam und Gilbert), Kettenabbruch durch Einbau von Didesoxynukleotiden (Sanger) oder Detektion von Lichtsignalen bei Einbau von Nukleotiden (Pyrosequenzierung). Die Sequenzierung nach Maxam und Gilbert, sowie die Sanger-Sequenzierung ermitteln die Abfolge anschließend durch Trennung verschieden langer Fragmente in der Gel-Elektrophorese. Die Nukleotidfolge in der Pyrosequenzierung wird allerdings über ein Computerprogramm ermittelt. 

Das Sequenzieren von DNA ermittelt die Reihenfolge der Nukleotidbasen (Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin) in der DNA. Mit diesem Wissen kann man auch auf den Bau codierter Proteine schließen.

Die DNA-Sequenzanalyse wird in der medizinischen Diagnostik von Erbkrankheiten und der Untersuchung von DNA-Mutationen genutzt. In der Phylogenetik wird sie verwendet um Verwandtschaftsgrade zu untersuchen und anschließend Stammbäume zu erstellen.

Wie lange eine DNA- Sequenzierung dauert ist von der verwendeten Methode und der Länge des DNA-Strangs abhängig. Während ältere Methoden sehr lange brauchen, um längere Sequenzen zu entschlüsseln, ermöglicht das "Next Generation Sequencing" die Sequenzierung eines ganzen Genoms innerhalb einiger Tage.

Finales Sequenzanalyse Quiz

Frage

Was ist die Sequenzanalyse?

Antwort anzeigen

Antwort

Die Sequenzanalyse ist ein Verfahren für die Ermittlung der Reihenfolge der Nukleotidabfolge der DNA.

Frage anzeigen

Frage

Beschreibe kurz den Ablauf der Methode von Maxam und Gilbert

Antwort anzeigen

Antwort

Eine doppelstrangige DNA wird auf jeder Seite des Einzelstrangs mit einem radioaktiven Primer markiert und schließlich durch Denaturierung in zwei Einzelstränge aufgetrennt. In vier verschiedenen Reaktionsvorgängen werden sie mit Lösungen bestimmter Chemikalien behandelt, die jeweils spezifische Nukleotide zerstören. Durch die Gel-Elektrophorese wird dann ermittelt wo der Standort der abgespaltenen Basen war. 

Frage anzeigen

Frage

Wie wird die Sequenzierung nach Sanger und Coulsen noch genannt? 

Antwort anzeigen

Antwort

Sie wird auch als Kettenabbruch-Synthese bezeichnet.

Frage anzeigen

Frage

Beschreibe kurz den Ablauf der Sequenzanalyse nach Sanger

Antwort anzeigen

Antwort

Eine einzelstrangige DNA wird genutzt. Ein dazu passender DNA-Strang wird synthesiert. Ein Primer wird dazu gegeben, der die Synthese startet. Hinzu werden Didesoxynukleotide gefügt, die radioaktiv markiert sind. Beim Einbau dieser Didesoxynukleotide während der Synthese, kommt es zu einem Kettenabbruch. Die Abbruchstellen werden durch Gel-Elektrophorese ermittelt und von einem Detektor abgelesen. Der Computer berechnet dann die Basensequenz im DNA-Molekül.

Frage anzeigen

Frage

Nenne ein Beispiel für ein modernes Sequenzierverfahren

Antwort anzeigen

Antwort

Die Pyrosequenzierung

Frage anzeigen

Frage

Wie werden moderne Sequenzierverfahren noch bezeichnet?

Antwort anzeigen

Antwort

Sie werden auch als Next generation Sequencing bezeichnet

Frage anzeigen

Frage

Beschreibe kurz den Ablauf der Pyrosequenzierung

Antwort anzeigen

Antwort

Es werden gezielt Nukleotide während der DNA-Synthese eingebaut. Bei einem Einbau, wird jeweils ein Lichtsignal gemessen. Das Lichtsignal wird von einem Detektor aufgefangen und in eine Basensequenz umgerechnet. 

Frage anzeigen

Frage

Woher stammt die Energie für das Licht bei der Pyrosequenzierung?

Antwort anzeigen

Antwort

Die Energie die das Lichtsignal erzeugt stammt vom Pyrophosphat (zwei Phosphatgruppen). Bei einem Einbau von Nukleotiden fürt es zu einem Lichtblitz.

Frage anzeigen

Frage

Wie wird die Sequenzanalyse in der medizinischen Diagnostik genutzt?

Antwort anzeigen

Antwort

Sie wird genutzt um Erbkrankheiten zu erkennen und sie mit DNA-Sequenzen gesunder Patienten zu vergleichen. Die Mutationen in der DNA-Sequenz werden ermittelt, um bei z.B. Neugeborenen die Erbkrankheiten zu frühzeitig zu therapieren.

Frage anzeigen

Frage

Wo wird die Sequenzanalyse in der Medizin noch genutzt?

Antwort anzeigen

Antwort

In der Erforschung von Antibiotika Resistenzen. Die DNA-Mutationen werden untersucht, um entsprechende Medikamente entwickeln zu können. 

Frage anzeigen

Frage

Wie wird die Sequenzanalyse in der Phylogenetik genutzt?

Antwort anzeigen

Antwort

Sie wird genutzt um Verwandtschaftsgrade zu untersuchen. Aus diesen Informationen können dann Stammbäume erstellt werden.

Frage anzeigen

Frage

Was ist die Phylogenetik?

Antwort anzeigen

Antwort

Es ist das Gebiet welches sich mit der Stammesgeschichte der Lebewesen beschäftigt.

Frage anzeigen

Frage

Wofür wird die Sequenzanalyse genutzt?

Antwort anzeigen

Antwort

Die Reihenfolge der Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin in der DNA wird analysiert.

Frage anzeigen

Frage

Wie werden Moleküle für die Sequenzanalyse in kleinere Bruchstücke geteilt?

Antwort anzeigen

Antwort

Das passiert auf chemischen Weg oder mithilfe von Enzymen wie Proteasen oder Restriktionenzymen.

Frage anzeigen

Frage

Was wird bei der Sequenzanalyse der DNA untersucht? Was bei Proteinen?

Antwort anzeigen

Antwort

Bei der DNA werden die Zahl und Lage von Genen und ihre zugehörige Funktionen in der Zelle untersucht, bei Proteinen wird die Faltung der Aminosäureketten untersucht.

Frage anzeigen
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