Wie groß ist der Unterschied zwischen Affen und Menschen eigentlich wirklich? Auf diese und weitere Fragen der Evolutionsforschung findet die vergleichende Molekularbiologie eine Antwort.
Molekularbiologie Definition
Wie lässt sich Molekularbiologie definieren?
Die Molekularbiologie beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der DNA und RNA, aber auch mit der Proteinzusammensetzung eines Lebewesens. Die Replikations-, Transkriptions- und Translationsmechanismen sind deshalb essenziell in der Molekularbiologie.
Die Basis molekularbiologischer Untersuchungen sind DNA, RNA und Proteine. DNA und Proteine können dabei als Vergleichsstrukturen dienen.
Du willst genaueres zu DNA und Proteinen wissen? Dann schau doch bei den jeweiligen Erklärungen vorbei! Genauso kannst Du Informationen zu den Ähnlichkeiten von DNA und Proteinen finden.
Vergleichende Molekularbiologie
Von vergleichender Molekularbiologie spricht man, wenn der Einsatz molekularbiologischer Verfahren darauf abzielt, Verwandtschaftsverhältnisse zwischen verschiedenen Spezies zu ermitteln. Es handelt sich insofern also um ein spezielles Anwendungsgebiet, in dem Lebewesen auf molekularer Ebene miteinander verglichen werden.
Die vergleichende Molekularbiologie ist sehr bedeutend für die Paläontologie, da diese die Weiterentwicklung von Leben im Rahmen der Evolution genauer untersucht.
Aufgaben der Molekularbiologie
Zur Molekularbiologie gehört, wie oben genannt, die vergleichende Molekularbiologie, die dabei hilft, die Evolution besser nachzuvollziehen.
Damit im Zusammenhang steht die Genetik als weiteres Einsatzgebiet der Molekularbiologie. Die Erkenntnisse aus der Untersuchung von DNA, RNA und ihre Interaktionen können also insgesamt in ganz verschiedenen Bereichen von Nutzen sein. Dazu gehören:
- Verbesserung des Verständnisses von grundlegenden Funktionen der Zelle und des Körpers, auch Krankheiten können so genauer erklärt und therapiert werden
- Entschlüsselung des genetischen Codes
- Aufstellung von Stammbäumen von Spezies
- Auffinden von genetischen Krankheitsursachen
- Gentechnik inkl. Gentherapie
Die Molekularbiologie vereint Gebiete aus
Biologie,
Genetik, Chemie und Biochemie.
Molekularbiologie Genetik
Ein Teilgebiet der Molekularbiologie ist die Molekulargenetik. Sie betrachtet Vererbung, Vervielfältigung und Expression von Erbgut (DNA). Dabei ist der Fluss von Informationen ausgehend von der DNA hin zu Proteinen besonders relevant. Er wird im sogenannten zentralen Dogma der Molekularbiologie zusammengefasst.
Der Begriff Dogma impliziert, dass es sich um einen unumstößlichen Lehrsatz handle. Dies ist jedoch nicht der Fall, weshalb die Bezeichnung heute kritisch betrachtet wird. Viel mehr handelt es sich um eine zentrale Hypothese oder Theorie, die widerlegt werden könnte.
Über die Transkription wird mit DNA als Vorlage eine mRNA erstellt. Diese dient dann in der Translation als Grundlage für die Zusammensetzung eines Proteins. Jedes Basentriplett (Codon) kodiert dabei für eine Aminosäure. Über reverse Transkription kann aus mRNA wieder auf DNA rückgeschlossen werden. Eine Rückkehr von Proteinen zu mRNA ist jedoch nicht möglich.
Methoden der Molekularbiologie
Die Methoden der vergleichenden Molekularbiologie sollen zeigen, wie nah zwei verschiedene Spezies miteinander verwandt sind. Die Verwandtschaftsanalyse kann auf der Ebene der DNA und der Proteine erfolgen. Die verschiedenen Techniken vergleichen also entweder eine Aminosäure- oder DNA-Sequenz.
Vergleich von Proteinen
Bei der Gegenüberstellung von Proteinen handelt es sich um einen Aminosäuresequenzvergleich. Er wird oft für die Verwandtschaftsanalyse eingesetzt.
Wenn man davon ausgehen kann, dass alle Lebewesen von einem gemeinsamen Vorfahren stammen, sollten sich die Aminosäuresequenzen bei unterschiedlichen Arten ähneln. Je näher verwandt die Lebewesen, desto weniger Unterschiede gibt es in der Aminosäuresequenz. Die Veränderungen der Aminosäuresequenz treten durch Mutationen auf.
Typische Proteine, an denen man die Aminosäuresequenz vergleichen kann, sind z. B. Insulin und Cytochrom C, denn sie kommen bei fast allen Lebewesen vor.
Methoden zum Aminosäuresequenzvergleich sind unter anderem der Edman-Abbau und der Serum-Präzipitin-Test.
Edman-Abbau
Beim Edman-Abbau wird die Aminosäuresequenz direkt nachgewiesen. Ein Protein wird fragmentiert, also in kleinere Abschnitte zerlegt, und dann dessen endständige Aminosäure abgespalten. Die abgespaltene Aminosäure kann über weitere Reaktionen festgestellt werden. Dies geschieht so oft, bis das ganze Protein sequenziert ist.
Serum-Präzipitin-Test
Der Serum-Präzipitin-Test ist ein Antigen-Antikörper-Test, der die Übereinstimmung von Proteinen prüft. Mit einem solchen Test kann die immunologische Verwandtschaft verschiedener Tiere nachgewiesen oder widerlegt werden. Dazu werden die Eigenschaften verschiedener Blutbestandteile ausgenutzt.
Das Blutplasma ist der Anteil des Blutes, der keine Zellen beinhaltet. Das Plasma entsteht, wenn eine Blutprobe zentrifugiert wird.
Das Blutserum entsteht, nachdem aus dem zellfreien Plasma ebenfalls alle Gerinnungsfaktoren entfernt wurden.
Wie wird ein Präzipitintest durchgeführt? Im folgenden Beispiel wird die Untersuchung mit menschlichem Blut durchgeführt, es ist aber auch auf jegliche andere Spezies übertragbar.
- Einem Menschen wird Blut entnommen.
- Das geronnene Blut wird zentrifugiert, sodass das Serum als Überstand verbleibt.
- Das Serum wird einem anderen Lebewesen injiziert. Meistens handelt es sich um Kaninchen oder Hühner. Diese Organismen entwickeln Antikörper gegen menschliche Serum-Bestandteile.
- Nach einigen Wochen wird den Tieren Blut abgenommen. Hier wird wieder gewartet, bis sich das flüssige Serum vom Plasma getrennt hat.
- Sollte dieses Serum wieder mit menschlichem oder tierischem Blut vermischt werden, entsteht eine Ausfällung. Die Ausfällung entsteht dadurch, dass die Antigene im Blut mit Antikörpern bekämpft werden. Je näher die Verwandtschaft, desto größer ist die Ausfällung.
Ein Präzipitintest ist allerdings sehr ungenau und liefert keine konkreten oder manchmal sogar widersprüchliche Ergebnisse. Das liegt vorwiegend daran, dass die Ergebnisse je nach Referenztier stark voneinander abweichen können. Heutzutage verwendet man deshalb stattdessen die DNA-Sequenzierung oder andere Methoden der Aminosäuresequenz-Analyse.
Vergleich von DNA
Weitere Methoden arbeiten auf Ebene der DNA bzw. manchmal auch der RNA. Dazu muss das genetische Material zunächst aufbereitet werden. Danach ist es bereit für verschiedene Sequenzierungstechniken.
Sequenzierungstechniken werden genutzt, um die Basenabfolge eines DNA-Fragments zu identifizieren.
Vorbereitung des genetischen Materials
Die DNA durchläuft verschiedene Schritte, bei denen z. B. ein gewünschter Abschnitt extrahiert und vervielfältigt werden kann.
DNA-Restriktion
Meistens wird für die Forschung nur ein bestimmtes Gen oder ein Gen-Abschnitt benötigt. Um an diese zu gelangen, wird auf DNA-Restriktion zurückgegriffen. Dabei wird die DNA mithilfe einiger Restriktionsenzymen in Abschnitte geteilt. Der Vorteil von Restriktionsenzymen ist, dass diese eine bestimmte Basenabfolge erkennen können. Sie können den DNA-Strang an dieser Stelle durchschneiden.
Restriktionsenzyme sind sogenannte molekulare Scheren, die die isolierte DNA in Stücke schneiden.
Aus den verschiedenen DNA-Abschnitten nimmt man sich das spezifische Stück, worauf das gesuchte Gen liegt. Die DNA-Stücke werden in diesem Fall mithilfe der Gelelektrophorese nach der Länge sortiert.
Polymerase-Kettenreaktion
Die weitere Vorbereitung erfolgt meist mithilfe einer PCR (Polymerase Chain Reaction).
Die Polymerase Chain Reaction – auch Polymerase-Kettenreaktion – ist ein enzymabhängiges Verfahren, um bestimmte Gen-Sequenzen innerhalb einer DNA-Kette zu vervielfältigen. Die spezifischen DNA-Abschnitte werden später für andere Prozesse gebraucht.
In dem Verfahren der PCR wird ein doppelsträngiger DNA-Abschnitt benötigt, welcher die gesuchte Gen-Sequenz enthält. Damit die Vervielfältigung durchgeführt werden kann, werden zwei Primer, sogenannte Oligonukleotide, eingesetzt. Diese binden an den Anfangs- und Endpunkten des DNA-Abschnitts. Die Oligonukleotide sind zwischen 15 und 25 Basen lang. Ihre Aufgabe ist es, den Bereich, der vervielfältigt werden soll, zu begrenzen.
Für die PCR werden zusätzlich Desoxynukleosidtriphosphate (für den Neuaufbau der DNA-Stränge), Ionen und Puffer benötigt.
Die PCR ist ein zyklischer Prozess und wird in einem Thermocycler durchgeführt. Eine durchschnittliche PCR hat zwischen 25 und 40 Zyklen, wobei in jedem Zyklus die Menge der DNA verdoppelt wird. Die PCR wird in drei Schritten durchgeführt und jeder Schritt dauert etwa 30 Sekunden:
- Denaturierung
- Hybridisierung/ Anlagerung der Primer (Annealing)
- Verlängerung (Elongation)
Ein Thermocycler ist ein Gerät, das die Temperaturzyklen einer PCR selbstständig steuern kann.
Damit die DNA denaturieren oder schmelzen kann, wird ein PCR-Ansatz auf ca. 95 °C erwärmt. Dabei werden die Wasserstoffbrücken zwischen der beiden Strängen der DNA gespalten. Danach liegen komplementäre Einzelstränge vor.
Anschließend wird die Temperatur auf 55 bis 65 °C gesenkt. Der passende Primer kann an den beiden DNA-Einzelsträngen binden. Die Voraussetzung für eine erfolgreiche Anlagerung der Primer ist, dass die Sequenz der Primer mit der Basenabfolge des DNA-Strangs übereinstimmt. Sonst kann keine Anlagerung erfolgen.
Die Temperatur wird wieder erhöht. Dieses Mal auf 68 bis 72 °C. Diese Temperatur bietet die optimale Arbeitstemperatur für die spezielle DNA-Polymerase, wodurch die Synthese beschleunigt wird. Somit kann sich die DNA-Polymerase an die Primer anlagern. Zu dem neuen Strang fügt die DNA-Polymerase komplementäre Nukleotid-Bausteine hinzu.
Der Reaktionsansatz wird anschließend auf etwa 95 °C erhitzt. So kann ein neuer PCR-Zyklus beginnen.
Es gibt verschiedene Varianten der PCR. Dazu gehört auch die quantitative PCR (kurz qPCR). Neben der reinen Vervielfältigung findet dabei auch eine Messung der Menge des genetischen Materials statt.
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
Diese kompliziert klingende Methode wird beispielsweise bei forensischen Untersuchungen oder für Vaterschaftstests angewendet. Sie dient dabei der Bestimmung eines individuellen genetischen Fingerabdrucks.
Mit einer PCR wird die DNA amplifiziert. Danach kommt das oben beschriebene Prinzip der Restriktionsenzyme zum Einsatz. Bei jedem Individuum entstehen nach Hinzugabe der Enzyme verschieden lange Fragmente, da sich die vorhandenen Schnittstellen in der DNA unterscheiden. Ordnet man die Fragmente mithilfe einer Gelelektrophorese der Länge nach, so entsteht ein spezifisches Muster. Die Technik eignet sich sehr gut, um die DNA aus zwei Proben miteinander zu vergleichen.
Bei einer Gelelektrophorese werden Moleküle in einem elektrischen Feld entsprechend ihrer Größe getrennt. DNA ist negativ geladen und wandert deshalb in Richtung Anode. Im Gel befinden sich Poren, die eine Art Sieb bilden. Dieses ist für kleinere DNA-Abschnitte leichter zu passieren als für große, entsprechend gelangen sie am weitesten zum positiven Pol.
DNA-Sequenzierung nach Sanger
Die DNA-Sequenzierung ist ein Analyseverfahren, welches die Basenabfolge der DNA bestimmt. Dieses Analyseverfahren wird benutzt, um die Erbinformation von Lebewesen zu entschlüsseln. Zur DNA-Sequenzierung stehen eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung
Die Sanger-Sequenzierung kennt man auch als Didesoxymethode oder Kettenabbruchmethode. Heutzutage wird sie allerdings nicht mehr ganz so häufig angewendet, weil auch neuere Methoden wie die Pyrosequenzierung (Next Generation Sequencing) zur Verfügung stehen.
Näheres über die DNA-Sequenzierung nach Sanger kannst Du in der Erklärung Sanger-Sequenzierung erfahren!
Wie wird die Sanger-Sequenzierung durchgeführt?
1. Schritt: Denaturierung
Da die DNA als ein Doppelstrang vorliegt, wird sie erst aufgetrennt, indem sie auf etwa 90 °C für eine Minute erhitzt wird. Dadurch zerstört die Hitze die vorliegenden Wasserstoffbrücken zwischen den Basen. So werden die Doppelstränge getrennt und es liegen dann zwei Einzelstränge vor. Einer der beiden DNA-Stränge wird als Matrize verwendet.
2. Schritt: Anlagerung der Primer
Ein künstlicher Primer setzt sich an das 3'-Ende des Einzelstrangs. Der Primer legt durch seine Bindung an einer bestimmten Stelle am Matrizenstrang den Startpunkt der Synthese fest.
3. Schritt: Generierung der DNA-Fragmente
Damit DNA-Fragmente im Labor hergestellt werden können, werden einige spezifische Stoffe benötigt:
- die vorher erstellten Matrizen mit Primern
- Nukleotide in Form von dNTP und ddNTP von verschiedenen Basen
- das Enzym DNA-Polymerase, welches die DNA aus den Nukleotiden synthetisiert
Um einen komplementären Strang zum Matrizenstrang zu synthetisieren, werden Nukleotide mit den vier Basen (A, T, G, C) gebraucht. Es werden vier identische Reaktionsmedien hergestellt, um später die Basen zu unterscheiden. Die Reaktionsmedien beinhalten eine Matrize mit angelegtem Primer und Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) der vier Basen.
Zusätzlich werden Abbruchnukleotide (Didesoxynukleotidtriphosphate, ddNTPs) hinzugefügt, welche die Synthese der komplementären Strangs anhalten sollen. Jedes Reaktionsmedium enthält eine andere Art eines Abbruchnukleotids.
Ein Reagenzglas beinhaltet mehrere Adenin-ddNTPs (ddATP), ein anderes mehrere Thymin-ddNTPs (ddTTP), das nächste viele Cytosin-ddNTPs (ddCTP) und das letzte Reagenzglas beinhaltet Guanin-ddNTPs (ddGTP).
In dem Reagenzglas, wo ddGTP hinzugefügt wurde, wird nur nach Guanin abgebrochen. Das bedeutet, dass das letzte Nukleotid des vorliegenden DNA-Strangs immer Guanin ist.
Ähnlich zum Ablauf der DNA-Replikation werden komplementäre DNA-Nukleotide mithilfe der DNA-Polymerase an die Matrize gesetzt. Die Synthese beginnt am Primer. Solange die DNA-Polymerase kein Abbruchnukleotid findet, kann diese weiter arbeiten. Am Ende wird die Synthese durch ein ddNTP beendet. Da die ddNTPs immer an verschiedenen Stellen an dem DNA-Strang liegen, entstehen immer unterschiedlich lange DNA-Fragmente.
Die DNA-Fragmente in einem Reagenzglas enden immer mit der gleichen Base.
4. Bestimmung der Basenabfolge
Am Ende des Prozesses müssen die DNA-Doppelstränge erneut erhitzt werden, um die synthetisierten DNA-Fragmente von dem DNA-Einzelstrang zu entfernen. Die neuen Fragmente der DNA werden je nach Gewicht mit der Gelelektrophorese geordnet. Mithilfe der Position im Gel und den ddNTPs am Ende des Strangs kann nun die Basenabfolge abgelesen werden. An den Abbruchstellen sieht man dann, welche Abbruchnukleotide vermerkt wurden.
Next Generation Sequencing
Die Sanger-Sequenzierung ist eine vergleichsweise aufwendige Methode, mit der nur kleinere DNA-Abschnitte entschlüsselt werden können. Effizienter arbeiten die Verfahren des Next Generation Sequencing, kurz NGS.
Next Generation Sequencing beschreibt eine Gruppe von Techniken, die DNA deutlich schneller sequenzieren können als herkömmliche Methoden wie die Sanger-Sequenzierung. Sie sind zudem kostengünstiger und laufen meist automatisiert ab.
Beim NGS werden zunächst viele DNA-Fragmente erzeugt, die vervielfältigt werden. Viele Sequenzierungen können parallel ablaufen, was die Verfahren sehr effizient macht. In der Regel werden stattfindende Basenpaarungen detektiert und anschließend analysiert.
Ein Beispiel für Next Generation Sequencing ist die Pyrosequenzierung. Kommt es zu einer Basenpaarung, wird zuvor gebundenes Pyrophosphat frei, was über verschiedene Reaktionen zur Entstehung eines Lichtblitzes führt, der elektronisch registriert wird.
DNA-Hybridisierung
Die DNA-Hybridisierung ist ebenfalls gut geeignet zur Analyse von Verwandtschaftsbeziehungen.
DNA-Hybridisierung ist eine Methode der vergleichenden Molekularbiologie, die auf der Zusammenlagerung zweier verschiedener DNA-Einzelstränge zu einem Doppelstrang basiert. Anhand der Bindungsstärke können Rückschlüsse auf die Verwandtschaft geschlossen werden.
Zu Beginn der DNA-Hybridisierung wird doppelsträngige DNA so hoch erhitzt, dass sich zwei Einzelstränge bilden. Man spricht dabei auch von Denaturierung. Nun werden Einzelstränge verschiedener Herkunft miteinander vermischt und die Temperatur so weit gesenkt, dass sich zwei komplementäre Stränge aneinander lagen können. Es bildet sich Hybrid-DNA, die Stränge unterschiedlicher Spezies beinhaltet.
Anschließend wird die DNA erneut erhitzt. Je höher der Verwandtschaftsgrad ist, desto später lösen sich die Wasserstoffbrücken wieder voneinander. Eng verwandte Spezies bilden stärkere Bindungen aus, da die DNA-Stränge mehr komplementäre Basenpaare enthalten. So lässt sich vom Zeitpunkt der Denaturierung auf die Verwandtschaft schließen.
Blotting
Die DNA-Hybridisierung kommt auch bei einem Verfahren namens Blotting zum Einsatz.
Blotting ist ein Verfahren, welches verwendet wird, um DNA- und RNA-Fragmente oder Proteine nach der Gelelektrophorese auf eine sogenannte Trägermembran zu übertragen. So werden sie biochemisch nachgewiesen.
Die Blotting-Technik funktioniert nicht nur für DNA, bei der die Verankerung in der Membran über DNA-Hybridisierung möglich ist, sondern auch für Proteine und RNA. Während man bei DNA vom Southern Blot spricht, gibt es den Western Blot für Proteine und den Northern Blot für RNA. Um einen Überblick zu geben, werden auch diese Blots hier mitbehandelt.
Die Methode des Blotting wurde von dem Molekularbiologen und Biochemiker Edwin Southern erfunden. Seine Absicht war, Gene zu isolieren. Er fand das Prinzip, das Elektrophoresesegel zu zerhacken, aufwendig und ineffektiv und suchte nach einem neuen Weg, Gene zu isolieren. Stattdessen transferierte er die zu isolierenden Gene auf eine Nitrocellulose-Membran. Anschließend wurde dies auf einem Röntgenfilm hybridisiert. Somit waren die Gene auf der Membran sichtbar.
Die anderen Verfahren wurden in Anlehnung an seinen Namen ebenfalls nach Himmelsrichtungen benannt.
Allgemein wird ein Gel, eine Membran aus Nylon oder Nitrozellulose und ein Transferpuffer gebraucht. Im Prinzip verlaufen alle Methoden gleich.
| Name | Ablauf | Ausgangsmaterial |
| Southern Blot | Prinzipiell wird die DNA, die untersucht werden soll, erst isoliert, dann mit Restriktionsenzymen behandelt. Danach werden die DNA-Fragmente mittels Gelelektrophorese nach Größe getrennt.Das Muster, das durch die Gelelektrophorese entstanden ist, wird auf eine Membran übertragen. Die Membran wird dann mit radioaktiv, chemisch oder fluoreszierend markierter DNA oder RNA inkubiert, um die Nukleinsäuren auf die Membran zu fixieren. Einzelstränge entstehen, wenn die Sonde erhitzt wird. Bei 40–60 °C wird die Sonde mit der Zielsequenz auf der Membran hybridisiert, während die ungebundenen Sonden ausgewaschen werden. Zuletzt wird ein Röntgenfilm auf die Membran gelegt. Die Bereiche der stattgefundenen Hybridisierung werden durch die β-Strahlung schwarz markiert. | DNA |
| Northern Blot | Durch das Northern Blotting ist es möglich, RNA-Sequenzen auf eine Membran zu übertragen. Nach einer Gelelektrophorese können spezifische RNA-Sequenzen auf der Membran markiert werden. Dazu ist ebenfalls eine Hybridisierung nötig. | RNA |
| Western Blot | Die Technik des Western Blot wird angewandt, um die Qualität und Menge bestimmter Proteingemische oder einzelner Proteine zu untersuchen. Es erfolgt ebenfalls eine Gelelektrophorese, im Anschluss werden die sortierten Proteine auf eine Membran übertragen. Sie können mithilfe von spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. | Proteine |
Molekularbiologie einfach erklärt
Wie lässt sich Molekularbiologie einfach erklären und so das oben erwähnte zusammenfassen? Molekularbiologie setzt sich mit DNA, RNA und Proteinzusammensetzung von Lebewesen auseinander. Um diese zu untersuchen, gibt es verschiedene Methoden, die auf DNA oder Proteinebene ansetzen können. Nutzt man sie, um Evolution und Verwandtschaftsverhältnisse besser nachvollziehen zu können, spricht man von vergleichender Molekularbiologie.
Die Einsatzgebiete der Molekularbiologie sind vielfältig und reichen von der Aufstellung von Stammbäumen bis hin zur Therapieentwicklung für verschiedene Krankheiten.
Molekularbiologie – Das Wichtigste
- Molekularbiologie Definition: Molekularbiologie beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der DNA und RNA, sowie der Proteinzusammensetzung von Lebewesen.
- Vergleichende Molekularbiologie: Vergleichende Molekularbiologie dient der Ermittlung von Verwandtschaftsbeziehungen verschiedener Spezies, sie kann auf Ebene der DNA und Proteine ansetzen.
- Molekularbiologie Genetik: Bedeutende Prozesse sind Replikation, Transkription und Translation (Dogma der Molekularbiologie).
- Molekularbiologie Methoden: Wichtige Methoden auf Basis der Proteine sind der Edman-Abbau und der Serum-Präzipitin-Test. Zu Methoden auf Basis der DNA gehören u. a. die DNA-Sequenzierung (z. B. mittels Sanger-Sequenzierung oder NGS) und die DNA-Hybridisierung.
Nachweise
- viamedici.de: Elektrophorese, Analyse von Sequenzpolymorphismen, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. (16.09.2022)
- viamedici.de: Gentechnik: Überblick. (16.09.2022)
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