Viele Mechanismen, die in der Natur für wichtige Prozesse verantwortlich sind, können im Rahmen der Gentechnik umfunktioniert werden, um gezielt einen Zweck zu erfüllen. Ein Beispiel dafür sind Restriktionsenzyme – Enzyme, die als eine Art molekulare Genschere dienen. Diese Eigenschaft macht sie für die Genetik so interessant.
Enzyme sind spezielle Proteine, die chemische Reaktionen in einem Organismus beschleunigen oder ermöglichen, indem sie die dafür benötigte Energie herabsetzen. Für einen genaueren Einblick in die Welt der Enzyme kannst Du im StudySmarter-Artikel zu Enzyme vorbeischauen!
Restriktionsenzyme Definition
Restriktionsenzyme sind Enzyme, welche einen DNA-Doppelstrang an oder in der Nähe einer definierten Basensequenz schneiden und somit durchtrennen können.
Restriktionsenzyme Funktion
Restriktionsenzyme werden auch als Restriktionsendonukleasen (REN) bezeichnet. Um einen DNA-Strang durchtrennen zu können, müssen sie zunächst mit ihrer Erkennungssequenz eine ganz bestimmte Sequenz der DNA finden.
Je nachdem, aus welchem Organismus das Restriktionsenzym stammt, unterscheidet sich diese Erkennungssequenz. Auch die Art von Schnitt, die durchgeführt wird, kann sich unterscheiden. Die Erkennungssequenz des Restriktionsenzym ist nur wenige Basenpaare lang und kann durch das Prinzip der komplementären Basenpaarung gebunden werden.
Komplementäre Basenpaare sind Adenin–Thymin und Guanin-Cytosin.
Während Exonukleasen eine endständige Abspaltung eines DNA-Bauteils durchführen, schneiden Endonukleasen die DNA innerhalb des Strangs durch. Eine Auffrischung zum Aufbau der DNA findest Du im StudySmarter-Artikel zur DNA!
Restriktionsenzyme in Prokaryoten
Zu den Prokaryoten zählen die Bakterien. Sie benutzen Restriktionsenzyme als Abwehrsystem gegen fremde DNA.
Fremde DNA in Bakterien kann zum Beispiel aus Bakteriophagen stammen. Bakteriophagen sind eine spezielle Art von Virus, die Bakterien infizieren und ihr Genom in diese injizieren. Das Genom der Bakteriophagen wird in das Genom der Bakterien eingebaut, die daraufhin – entsprechend der viralen DNA – neue Virenbestandteile herstellen. Aus diesen werden neue Viren zusammengesetzt, die die Bakterien töten und frei sind, um neue Bakterien zu infizieren.
Die fremde DNA weist im Gegensatz zur Bakterien-eigenen DNA keine Methylierungen (Modifikationen der DNA mit Methylgruppen) auf, und kann daher von Restriktionsenzymen als fremd erkannt werden. Fremde DNA wird dann kurzerhand zerschnitten, um sie für das Bakterium unschädlich zu machen. Aufgrund dieser Funktion haben Restriktionsenzyme auch ihren Namen: Sie beschränken, welche DNA im Bakterium vorhanden sein darf und üben somit eine Restriktion (Einschränkung) aus.
Restriktionsenzyme – Typen
Je nach ihrer Funktionsweise und ihrem Aufbau können Restriktionsenzyme in vier verschiedene Typen unterteilt werden.
- Typ 1 Restriktionsenzyme
- Typ 2 Restriktionsenzyme
- Typ 3 Restriktionsenzyme
- Typ 4 Restriktionsenzyme
Typ 1 Restriktionsenzyme
Typ 1 Restriktionsenzyme schneiden die DNA an einer zufälligen Stelle, die sich nicht unbedingt in der Nähe der Erkennungssequenz befinden muss. Die Enzyme vom Typ 1 sind komplex aufgebaut und bestehen meist aus mehreren Untereinheiten. Zudem benötigen sie ATP, sind also energieabhängig.
Adenosintriphosphat (ATP) ist der universelle Energieträger der Zelle. Bei seiner Spaltung wird Energie frei, die für verschiedene Prozesse in der Zelle genutzt werden kann.
Die Aufgabe dieser Enzyme ist nicht nur das Schneiden, sondern auch die Modifikation von DNA durch Methylierung. Dafür haben sie extra eine Methylierungs-Untereinheit. Diese Untereinheit ist dafür zuständig, Bakterien-eigene DNA Stränge, die schon zur Hälfte methyliert sind, an bestimmten Sequenzen fertig zu methylieren. Auf diese Weise kann verhindert werden, dass diese Stränge aus Versehen als fremd erkannt und durch Restriktionsenzyme zerstört werden.
Typ 2 Restriktionsenzyme
Typ 2 Restriktionsenzyme können die DNA in der Nähe oder innerhalb der Erkennungssequenz schneiden und werden daher am häufigsten in der Gentechnik verwendet. Die Schnittpunkte dieser Restriktionsenzyme sind genau bestimmt und befinden sich an palindromischen Sequenzen der DNA.
Eine palindromische Sequenz ist ein Abschnitt eines DNA Doppelstrangs, der auf beiden Seiten des Strangs die gleiche Abfolge an Basen besitzt. Das heißt, dass sich die Basen von beiden Seiten aus gleich lesen lassen.
Ein Beispiel wäre:
5' - AACGTT - 3'
3' - TTGCAA - 5'
Von 5' nach 3' gelesen, besitzen beide Sequenzen die gleiche Basenabfolge.
Der Typ 2 der Restriktionsenzyme benötigt für seine Arbeit keine Energie in Form von ATP. Durch seinen Schnitt können sowohl blunt als auch sticky ends erzeugt werden. Während blunt ends die Strang-Enden nach einem glatten Schnitt durch den DNA Doppelstrang beschreiben, entstehen sticky ends, wenn die Stränge jeweils einen Überhang haben.
Abbildung 1: blunt und sticky ends
Das Restriktionsenzym EcoRI stammt aus dem Bakterium Escherichia coli (kurz E. coli) und sorgt für einen DNA-Abschnitt mit sticky ends und fünf Basen als Überhang.
Typ 3 Restriktionsenzyme
Typ 3 Restriktionsenzyme benötigen ATP und schneiden einige Basenpaare entfernt von der Erkennungssequenz. Sie benötigen zwei identische, nicht palindromische DNA-Abschnitte auf demselben Strang, die entgegengesetzt (invers) zueinander angeordnet sind. Auch dieser Typ kann die DNA durch die Übertragung von Methylgruppen modifizieren.
Typ 4 Restriktionsenzyme
Beim Typ 4 handelt es sich um ein Restriktionsenzym, das nur modifizierte DNA schneiden kann. Der Typ 4 wurde primär in dem Bakterium E. coli aufgefunden. Bezüglich einer Erkennungssequenz zeigen sie nur schwache Spezifitäten.
Restriktionsenzyme in der Gentechnik
Die Funktion der Restriktionsenzyme als Abwehrmechanismus von Bakterien wird sich heutzutage in der Gentechnik zunutze gemacht. Restriktionsenzyme können als Genscheren verwendet werden, um Schnitte an spezifischen Sequenzen der DNA einzufügen.
Die Entdeckung der Restriktionsenzyme
In den 1950er-Jahren infizierten Salvador Luria, Jean Weigle und Giuseppe Bertani zwei verschiedene E. coli Bakterienstämme mit denselben Bakteriophagen und beobachteten, dass die Bakteriophagen nur in einem der Stämme gut wachsen und sich ausbreiten konnten.
In den 1960er-Jahren fanden Werner Arber und Matthew Meselson heraus, dass die Bakteriophagen sich deshalb nicht verbreiten konnten, weil ihre DNA durch ein Enzym der Bakterien zerschnitten wurde. Die Restriktion des Wachstums der Phagen führte zum Namen "Restriktionsenzym". Das Restriktionsenzym, das für ihre Experimente verantwortlich war, wird als Typ I Restriktionsenzym klassifiziert, da es an zufälligen Stellen der DNA außerhalb der Bindesequenz Schnitte einführte.
In den 1970er-Jahren konnten Hamilton O. Smith, Thomas Kelly und Kent Wilcox erstmals ein Typ II Restriktionsenzym isolieren. Diese Entdeckung war ein Meilenstein für die Gentechnik, da Typ II Restriktionsenzyme gezielt Schnitte in der DNA einfügen können. Ihre Errungenschaft führte sogar zu einem Nobelpreis für die drei Wissenschaftler im Jahre 1978.
Einsatzgebiete von Restriktionsenzymen in der Gentechnik
Restriktionsenzyme werden vor allem zur Klonierung verwendet. Dabei wird ein neues Gen in ein Plasmid eingebracht, das dann als Vektor in Bakterien aufgenommen und vervielfältigt wird.
Ein Plasmid ist die ringförmige DNA, die in Bakterien zu finden ist. Plasmide, die zum Transport von Genen verwendet werden, heißen Vektoren.
Da sich Bakterien schnell vermehren und sehr einfach zu halten sind, werden sie oft genutzt, um auch die Vektoren zu vermehren, die sie aufgenommen haben. Wenn das neu eingebrachte Gen außerdem für ein bestimmtes Protein kodiert, können sie dieses Protein in großen Mengen herstellen. Die Gewinnung von Proteinen auf diese Art ist ethisch vertretbarer und auch unaufwändiger, als dafür z. B. Tiere zu verwenden.
Bei der Krankheit Diabetes müssen sich viele Betroffenen Insulin verabreichen. Früher wurde Insulin aus den Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen gewonnen. Heutzutage werden gentechnisch veränderte Bakterien genutzt, um den hohen Bedarf an Insulin zu decken.
Der Vorgang der Klonierung kann in verschiedene Etappen unterteilt werden:
Das Schneiden durch Restriktionsenzyme
Plasmide, die als Vektoren genutzt werden, sollten eine Restriktionssequenz enthalten. Das ist eine Sequenz, die als Erkennungs- und Schnittstelle für Restriktionsenzyme genutzt werden kann. Das Restriktionsenzym (Typ II) hat eine Untereinheit, mit der sie diese Sequenz erkennen und binden kann, woraufhin das Plasmid an dieser Stelle geschnitten wird.
Je nach Restriktionsenzym entsteht dabei ein charakteristisches Schnittmuster mit blunt oder sticky ends und das Plasmid ist jetzt nicht mehr ringförmig, sondern geöffnet.
Die DNA, die später in den Vektor eingefügt werden soll, muss mit demselben Restriktionsenzym geschnitten werden, damit es später nahtlos in den Vektor eingefügt werden kann. In der Gentechnik ist es daher erwünscht, dass sticky ends entstehen. Die entstehenden Fragmente können dann wie Puzzleteile ineinander eingefügt werden.
Der Prozess des Schneidens von DNA und Plasmid durch Restriktionsenzyme wird in der Gentechnik auch als ein Restriktionsverdau bezeichnet.
Da Restriktionssequenzen nur wenige (4-12) Basenpaare lang sind und aus einer Kombination von nur vier verschiedenen Basen bestehen, kann es natürlich vorkommen, dass diese Sequenz mehrmals in dem DNA-Abschnitt vorhanden ist, der in den Vektor eingebracht werden soll.
Sollte das Restriktionsenzym an einer dieser anderen, identischen Sequenzen binden, würden unerwünschte Schnitte entstehen. Das kann dazu führen, dass nicht der richtige Abschnitt der DNA in den Vektor eingebaut wird. In einem solchen Fall kann einfach ein Restriktionsenzym aus einem anderen Bakterium verwendet werden, der eine andere Bindungssequenz verwendet.
Um daher flexibler in der Auswahl der passenden Restriktionsenzyme zu sein, enthalten Vektoren meist nicht nur eine bestimmte Restriktionssequenz, sondern eine sogenannte multiple cloning site (MCS). Das ist ein Bereich im Vektor-Plasmid, der mehrere Restriktionssequenzen für verschiedene Restriktionsenzyme enthält.
Die Hybridisierung der DNA
Wenn die passenden Fragmente durch Restriktionsenzyme zurechtgeschnitten sind, kann die neue DNA mit dem Vektor vermischt werden. Ziel ist es, dass sich die DNA-Fragmente in die Lücke des Vektors legen. Da sticky ends Überhänge besitzen, kann zwischen den Basen der Fragmente jeweils eine Hybridisierung erfolgen. Dabei bilden sich Wasserstoffbrücken zwischen zwei komplementären Basen und halten die beiden Stränge zusammen.
Abbildung 3: Hybridisierte sticky ends
Zwischen den Rückgraten der beiden DNA-Stränge bleiben allerdings noch kleine Lücken zurück, die für eine vollständige Stabilisierung der DNA geschlossen werden müssen. Dafür kommt die Ligase – auch als molekularer Kleber bezeichnet – zum Einsatz.
Ligasen sind Enzyme, die unter Energieverbrauch eine Verknüpfung im Rückgrat der DNA zwischen dem Phosphatrest eines Endes und einem Zuckerrest im anderen Ende erzeugen. Dabei entsteht eine sogenannte Phosphodiesterbindung.
Die fertigen Plasmide mit fest eingebauter DNA werden als Hybridplasmide bezeichnet.
Die Transformation der Plasmide
Nachdem die Hybridplasmide fertiggestellt sind, müssen sie in Bakterienzellen eingebracht werden. Dafür wird meist eine Transformation genutzt.
Transformation bezeichnet in der Genetik die Aufnahme fremder DNA durch Bakterienzellen.
Die Aufnahme der Hybrid-DNA durch Bakterien kann zum Beispiel durch eine abrupte Erhitzung (Hitzeschock) oder einen Elektroschock herbeigeführt werden. Sobald das Plasmid von den Bakterien aufgenommen wurde, können sie das genetische Material auf dem Plasmid ablesen und nutzen.
Beweis der Einschleusung
Um sicherzugehen, dass der Restriktionsverdau und die Transformation wie erwartet funktioniert haben, gibt es in der Gentechnik mehrere Methoden, Beweise dafür hervorzubringen.
Eine Methode ist die Verwendung von Markergenen. Das sind etwa Gene, die für eine Antibiotika-Resistenz codieren. Bakterien mit diesem Gen werden dann nicht abgetötet, wenn sie mit dem entsprechenden Antibiotikum in Kontakt kommen.
Ein DNA-Abschnitt beinhaltet eine Kanamycin-Resistenz. Die DNA wird in einen Vektor eingebaut, der jetzt ebenfalls die Resistenz-Sequenz besitzt. E. coli Bakterien werden mit dem Vektor transformiert und anschließend auf Platten ausgestrichen, die Kanamycin beinhalten.
Bakterien, die den Vektor nicht aufgenommen haben oder nur einen Vektor, bei dem die DNA nicht korrekt eingebaut wurde, haben keine Resistenz und sterben ab. E. coli, bei denen alle Vorgänge fehlerfrei funktioniert haben, überleben. Mit diesen Bakterien können alle folgenden Experimente durchgeführt werden.
Ein weiterer Beweis kann schon beim Stadium des Restriktionsverdau erfolgen. Durch eine Gelelektrophorese kann sichergegangen werden, dass beim Schneiden durch Restriktionsenzyme die richtigen Fragmente entstanden sind. Bei einer Gelelektrophorese werden DNA-Fragmente ihrer Größe nach aufgetrennt und ihre Größe kann anschließend ganz einfach abgelesen werden. Da meist vor dem Verdau bekannt ist, aus wie vielen Basenpaaren ein Plasmid besteht und an welcher Stelle die Restriktionsenzyme schneiden, kann berechnet werden, wie groß die Fragmente sein müssen, die beim Verdau entstehen. Mit der Gelelektrophorese kann dann überprüft werden, ob die gewünschten Produkte entstanden sind.
Restriktionsenzyme – Das Wichtigste
- Restriktionsenzyme sind Enzyme, die DNA je nach Typ an speziellen oder zufälligen Sequenzen schneiden können.
- Restriktionsenzyme werden häufig als Restriktionsendonukleasen bezeichnet, da sie innerhalb der DNA schneiden.
- Die Enzyme stammen aus Bakterien, wo sie eine Funktion als Abwehrmechanismen haben. Sie zerschneiden fremde DNA, um die Bakterienzelle vor einer Infektion zu schützen.
- Heutzutage kommen Restriktionsenzyme in der Gentechnik zum Einsatz. Sie werden als molekulare Schere genutzt, um DNA an gezielten Sequenzen zu zerschneiden und ins Genom von anderen Organismen (z. B. Bakterien) einzubringen.
Nachweise
- neb-online.de: Restriktionsenzyme. (05.06.2022)
- Mülhardt, C. (2009). Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. Spektrum Akademischer Verlag.
- Alberts et al. (2015). Molecular Biology of the Cell. W.W. Norton & Company.
- Marcy Patrick (2016): Plasmids 101: Methylation and Restriction Enzymes. blog.addgene.org (06.06.2022)
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