Sanger Sequenzierung

Zur Entschlüsselung des Genoms, also der Sequenzierung der gesamten DNA einer Zelle, gibt es verschiedene Methoden. Zu den klassischen Methoden der DNA-Entschlüsselung gehört die Sequenzierung nach Sanger.

Die Sequenzierung nach Sanger gehört zu den klassischen und älteren Methoden zur Entschlüsselung des Genoms. Inzwischen gibt es auch modernere Verfahren, die eine deutlich schnellere Aufschlüsselung ermöglichen; sie werden "Next Generation Sequencing"-Methoden genannt. Zu den NGS-Verfahren gehört z.B. die Pyrosequenzierung.

Sanger Sequenzierung einfach erklärt

Um den Ablauf der Sequenzierung nach Sanger zu verstehen, ist es wichtig, zuvor das Grundprinzip im Hinterkopf zu haben: Mithilfe von Enzymen sollen verschieden lange DNA-Stränge nach Vorlage der zu untersuchenden DNA generiert werden. Dabei sollen sich die vielen, unterschiedlich langen DNA-Stränge um jeweils nur ein Basenpaar unterscheiden.

Abbildung 1: Grundprinzip der Sanger-Sequenzierung

Diese DNA-Stränge können dann mithilfe einer Gelelektrophorese nach ihrer Länge geordnet werden, wodurch über einen Umweg die Basenabfolge ermittelt wird.

Sanger Sequenzierung – Ablauf

Im folgenden Abschnitt erfährst du, welche Ausgangsstoffe benötigt werden, wie die unterschiedlich langen DNA-Fragmente generiert werden und wie sie genutzt werden, um die DNA zu entschlüsseln.

Sanger Sequenzierung – Ausgangsstoffe

Für die Sequenzierung der DNA nach Sanger werden bestimmte Ausgangsstoffe benötigt. Dazu gehören:

• zu untersuchende DNA als Einzelstrang, genannt: Matrize
• Primer
• DNA-Polymerase
• Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTP)
  • es werden vier verschiedene Arten benötigt (Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin), welche an die Matrize binden
• Didesoxyribonucleotidtriphosphate (ddNTP)
  • hierbei fehlt eine OH-Gruppe an 3' Position - sie sorgen für den Abbruch einer Replikation und werden auch Abbruchnukleotide genannt
  • es werden ebenfalls vier verschiedene Arten benötigt (Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin)

Schritt 1: Denaturierung

Da DNA normalerweise nicht als Einzelstrang, sondern als Doppelstrang vorkommt, muss dieser zuerst über eine Denaturierung aufgetrennt werden.

Durch eine Erhitzung der DNA auf etwa 90 °C für eine Minute werden die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren zerstört und die beiden Doppelstränge so voneinander getrennt. Einer der beiden Stränge wird nun als Matrize verwendet, mit dem weiter fortgefahren wird.

Abbildung 2: Auftrennung der DNA in Einzelstränge

Schritt 2: Anlagerung der Primer

Wie bereits erwähnt, ist für den folgenden Prozess ein bekannter "Anfang" notwendig. Der Anfang, hier genannt Primer, besteht aus wenigen Nukleotiden, die komplementär zum Matrizenstrang sind.

Für die zu untersuchende DNA muss also ein spezifischer Primer hergestellt werden. Dafür muss ein kleiner Abschnitt der DNA bereits entschlüsselt sein, da sonst kein passender Primer erstellt werden kann.

Abbildung 3: Anlagerung des Primers

Der passende Primer bindet an die bestimmte Stelle am Matrizenstrang und erfüllt so die Bedingung, die von der DNA-Polymerase benötigt wird. Dies benötigt nur eine Zeit von etwa 3-6 Sekunden.

Schritt 3: Generierung der DNA-Fragmente

Die Herstellung der DNA-Fragmente erfolgt durch zwei Teilschritte. Dazu werden folgende Stoffe benötigt:

• Matrizen mit angelagerten Primern
• Nucleotide (mit den verschiedenen DNA-Basen)
  • in Form von dNTP und ddNTP
• DNA-Polymerase
  • Enzym, dass die DNA aus Nucleotiden synthetisiert – sie setzt komplementäre Nucleotide an die Matrize, benötigt dabei aber einen kleinen Anfang, um mit der Synthese beginnen zu können

Herstellung der Reaktionsmedien

Die DNA beinhaltet die vier Basen Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin. Sie kommen in der DNA als Teil von Nucleotiden vor.

Damit ein komplementärer Strang zur Matrize synthetisiert werden kann, müssen also Nucleotide mit den vier verschiedenen DNA-Basen gegeben sein.

Um die vier Basen später voneinander unterscheiden zu können, werden parallel vier identische Reaktionsmedien hergestellt. Diese beinhalten Matrizen, Primer und dNTPs (aller vier Arten).

Hinzu kommen Abbruchnucleotide (ddNTPs), welche die Synthese des komplementären Stranges stoppen. Der Unterschied zwischen den vier Reaktionsmedien ist, dass jedes Medium eine andere Art ddNTP enthält.

Ein Gefäß enthält Adenin-ddNTPs (ddATP), eins Thymin-ddNTPs (ddTTP), das nächste Guanin-ddNTPs (ddGTP) und das letzte Gefäß enthält Cytosin-ddNTPs (ddCTP) im Reaktionsmedium.

So wird in einem Gefäß beispielsweise nur nach Cytosin abgebrochen, da dort lediglich Cytosin-ddNTPs vorhanden sind. Das letzte Nucleotid des DNA-Stranges aus diesem Gefäß ist also immer Cytosin.

Synthese der DNA-Fragmente

Die Synthese der komplementären DNA-Stränge geschieht durch die DNA-Polymerase. Diese kann nun durch den angebundenen Primer mit ihrer Arbeit anfangen.

Wie bei der DNA-Replikation setzt die DNA-Polymerase komplementäre DNA-Nucleotide an die Matrize, beginnend am Primer. Der neue DNA-Strang wird immer länger, bis die DNA-Polymerase durch Zufall ein Abbruchnucleotid bindet.

Abbildung 4: Synthese der DNA-FragmenteQuelle: StudySmarter

Die DNA-Synthese wird abgebrochen. So entstehen mit der Zeit viele unterschiedlich lange DNA-Fragmente, da es Zufall ist, wann bzw. an welcher Stelle ein ddNTP angelagert wird. Die DNA-Fragmente in einem Gefäß enden dabei immer an der gleichen Base, da die bestimmten ddNTPs nur zu einer anderen Base komplementär sind.

Abbildung 5: Synthetisierte DNA-Fragmente der verschiedenen Reaktionsgefäße

Am Ende müssen die DNA-Doppelstränge erneut erhitzt werden, um die synthetisierten DNA-Fragmente von den Matrizen zu trennen.

Nun sind alle Stoffe, die zur Entschlüsselung der DNA erforderlich sind, gewonnen. Wie aus den einzelnen DNA-Fragmenten die Basenabfolge in korrekter Reihenfolge abgelesen werden kann, erfährst Du in der Auswertung.

Sanger Sequenzierung – Auswertung

Zur Auswertung der gewonnenen DNA-Fragmente wird eine Gelelektrophorese durchgeführt.

Mithilfe dieses Trennverfahrens ist es möglich, die DNA-Fragmente ihrer Länge nachzuordnen, wodurch die Abbruchnucleotide in der richtigen Reihenfolge die komplementäre Basenabfolge der Matrize wiedergeben.

Das funktioniert durch die Trennung der verschiedenen Arten der ddNTPs in vier Gefäße. So kann die Basenart am Ende des Fragments abgelesen werden. Da die Fragmente ihrer Länge nach aufgefächert wurden, ist es möglich, die Basenabfolge in der richtigen Reihenfolge lückenlos abzulesen.

Abbildung 7: Gelelektrophorese der synthetisierten DNA-Fragmente

Die nun ermittelte Basenabfolge ist komplementär zur Matrize. So kann auf die Basenabfolge der Matrize geschlossen werden. Die DNA ist somit erfolgreich sequenziert worden.

Sanger Sequenzierung – Anwendung

Die Sequenzierung der DNA ist in vielen Anwendungsbereichen von großer Bedeutung. In der medizinischen Diagnostik können so z.B. Erbkrankheiten erkannt werden, wodurch so früh wie möglich die passendste Therapie begonnen werden kann.

In der Abstammungsforschung können durch DNA-Sequenzierungen verschiedener Organismen bzw. Arten und deren Vergleich nähere Aussagen zu Verwandtschaftsbeziehungen getroffen werden. Dies dient unter anderem der Erstellung von Stammbäumen.

Dabei kommt jedoch nur selten die Sanger-Sequenzierung zum Einsatz, da sie im Vergleich zu moderneren Verfahren sehr aufwendig ist und viel Zeit in Anspruch nimmt.

Weitaus effizienter und schneller sind Verfahren des Next Generation Sequencing, mit denen ganze Genome in nur wenigen Tagen sequenziert werden können. Zu diesen Verfahren zählen z.B. die Pyrosequenzierung, die Halbleitersequenzierung und die Nanoporen-Sequenzierung.