Durch das Studium von Zellen können Wissenschaftler*innen erfahren, wie Organismen funktionieren, wie Krankheiten entstehen und wie man diese bekämpfen kann. Dafür müssen sie mehr über die Funktionen von Zellen, ihre Interaktionen oder Abläufe erfahren.
In der Biologie können dafür viele verschiedene Methoden angewendet werden, die sowohl oberflächliche als auch tiefergehende und detaillierte Untersuchungen zulassen. Dazu gehören zum Beispiel verschiedene Mikroskopietechniken.
Untersuchungsmethoden der Zellbiologie
Heutzutage werden Zellen auf sehr verschiedene Arten und Weisen untersucht, um ihre Funktion und ihren Aufbau sowie Reaktionen auf äußere Einflüsse näher zu verstehen. Dafür werden die biologischen Methoden der Zellbiologie auch oft mit chemischen Verfahren ergänzt.
Je nachdem, welche Methode zur Untersuchung angewendet wird, können verschiedene Mengen und Arten an Informationen erhalten werden. Während manche Methoden sogar erlauben, die Wege einzelner Proteine zu verfolgen, kann mit anderen Methoden lediglich die Zahl von Zellen in einer Probe bestimmt werden.
Unterschieden werden die Methoden der Zellbiologie auch darin, in welchem Zustand sich die untersuchten Zellen befinden. Nicht alle Methoden der Zellbiologie sind dafür geeignet, lebende Zellen zu untersuchen. Allerdings werden auch nicht in allen Experimenten zwingend lebende Zellen benötigt. Daher ist es wichtig, abzuwägen, was genau herausgefunden werden soll, bevor eine Methode angewandt wird.
Methoden der Zellbiologie: Methoden in der Mikroskopie
Der Begriff Mikroskopie stammt aus dem Griechischen und bedeutet übersetzt etwas Kleines betrachten oder untersuchen. Heutzutage wird unter Mikroskopie das Untersuchen kleinster Details verschiedener Organismen mithilfe eines Mikroskops verstanden.
Es wird zwischen Elektronen- und Lichtmikroskopie unterschieden. Die Betrachtung verschiedenster Zellstrukturen unter dem Mikroskop – sei es zur Charakterisierung, zur Interaktionsuntersuchung oder zur Suche nach Abnormalitäten – gehört zu den Grundlagen der Untersuchungsmethoden der Zellbiologie.
Lichtmikroskopie
Bei der Lichtmikroskopie werden die zu untersuchenden Präparate, zum Beispiel Mikroskopzellen, mit Licht angestrahlt.
Licht besteht aus Lichtstrahlen, die sich in Wellenform fortbewegen. Diese Wellen haben eine Wellenlänge (der Abstand zwischen zwei Höhepunkten einer Welle). Die Wellenlänge ist dafür verantwortlich, welche Farbe Menschen wahrnehmen, wenn Licht ins Auge fällt. Beträgt die Wellenlänge des Lichts zwischen 400 und 780 Nanometer, kann das Licht vom Gehirn als eine Farbe interpretiert werden.
Trifft ein Lichtstrahl auf ein Hindernis – in etwa die Probe unter dem Mikroskop – können verschiedene Dinge passieren: Das Licht kann reflektiert (zurückgeworfen) werden, es kann absorbiert (aufgenommen) werden oder es wird transmittiert (durchgelassen).
In der Lichtmikroskopie kann zwischen Durchlicht- und Auflichtmikroskopie unterschieden werden.
Bei der Durchlichtmikroskopie wird das Präparat von unten angestrahlt. Die Lichtstrahlen transmittieren durch die Probe und werden durch ein Linsensystem an das Auge weitergeleitet. Das Linsensystem leitet die Lichtstrahlen außerdem auf eine solche Weise, dass beim Betrachter ein vergrößertes Bild ankommt. Damit das Licht die Probe passieren kann, ist es nötig, dass die Probe sehr dünn präpariert wird.
Bei der Auflichtmikroskopie wird das Präparat nicht durchleuchtet, sondern von oben beleuchtet. Daher wird sie hauptsächlich dann genutzt, wenn die Probe lichtundurchlässig ist.
Durchlichtmikroskop: Unter dem Lichtmikroskop wird der Aufbau einer Zwiebelhaut betrachtet. Ihre Zellen werden vergrößert dargestellt.
Auflichtmikroskop: Unter dem Auflichtmikroskop wird ein Muttermal während der Untersuchung bei einem Hautarzt betrachtet. Die Vergrößerung lässt eine nähere Betrachtung und Analyse der Zellen zu.
Aufbau eines Lichtmikroskops
In folgender Abbildung kannst Du den Aufbau eines konventionellen Lichtmikroskops (Durchlichtmikroskop) und seine verschiedenen Bestandteile erkennen.
Die Probe wird zwischen zwei Glasscheiben auf dem Objektträger platziert. Mit dem Kondensor kann eingestellt werden, wie viel Licht von der Lichtquelle unter dem Objektträger auf die Probe gestrahlt wird. Am Revolverkopf sind mehrere Objektive mit unterschiedlichen Vergrößerungsstufen befestigt. In diesen Objektiven befinden sich Linsen, die von den Probe stammende Lichtstrahlen bündeln und durch den Tubus zum Okular leiten.
Der Weg, den Lichtstrahlen durch das Mikroskop und seine Linsensysteme nehmen, wird auch als Strahlengang bezeichnet. Je nachdem, wie die Linsen geformt sind, können die Lichtstrahlen dabei aufeinander zu gelenkt und somit gebündelt, oder voneinander weggelenkt werden. Die Linsen im Mikroskop müssen so angeordnet sein, dass Lichtstrahlen vom Präparat direkt durchs Okular gelenkt werden, und zwar so, dass beim Betrachter ein scharfes, vergrößertes Bild ankommt.
Der Tubus eines Mikroskops liefert eine Möglichkeit für die Lichtstrahlen, eine weite Strecke ohne Unterbrechungen geleitet zu werden. Dadurch ist es möglich, eine höhere Vergrößerung zu erreichen, die beim Betrachter ankommt.
Mithilfe des Grob- und Feintriebs wird der Abstand zwischen Objektträger und Objektiv verändert, sodass die Schärfe des entstehenden Bildes eingestellt werden kann.
| Bestandteile | Funktion |
| Okular | Linse, durch die das Präparat vergrößert betrachtet werden kann. |
| Tubus | Ermöglicht größere Brennweite des optischen Apparates. |
| Objektive | Besitzen unterschiedliche Vergrößerungsstufen. Können zur Betrachtung des Präparats durch Drehung des Revolverkopfs gewechselt werden. |
| Revolverkopf | Drehbares Modul, an dem die Objektive angebracht sind. |
| Objektträger/Objekttisch | Objektträger liegt auf höhenverstellbarem Objekttisch und trägt das Präparat. Besteht meist aus einer dicken und einer dünnen Glasscheibe, zwischen denen die Probe fixiert wird. |
| Kondensor | Blende, die das Licht bündelt und die Menge der Lichtzufuhr regelt. |
| Lichtquelle | Elektrisch erzeugtes Licht (Lampe) oder Spiegel, der das Tageslicht spiegelt. |
| Stativ | Trägt und stabilisiert die wichtigen, für die Optik relevanten, Bestandteile des Gerätes. |
| Fein- und Grobtrieb | Rädchen zur Höhenverstellung des Objekttisches. Wird genutzt, um das entstehende Bild scharfzustellen. |
Mehr Informationen und die genaue Funktionsweise eines Lichtmikroskops erfährst Du im dazugehörigen StudySmarter-Artikel zur Lichtmikroskopie!
Funktion des Lichtmikroskops
Um die Funktionsweise eines Mikroskops erklären zu können, sind vor allem zwei seiner Bestandteile wichtig: das Objektiv und das Okular.
Über die Blende wird das Licht genau auf die Probe fokussiert. Das darüberliegende Objektiv wirkt wie eine Sammellinse und führt die Strahlen weiter zusammen. Allerdings sind die Strahlen nach dem Objektiv nicht parallel zueinander, sondern wandern immer noch ein wenig auseinander. Genug, um eine Vergrößerung zu erzeugen, aber trotzdem so subtil, dass die Lichtstrahlen den langen Weg durch den Tubus nehmen können, ohne an die Wand zu geraten.
Wenn die Lichtstrahlen im Okular ankommen, sind sie viel weiter aufgespalten, als sie es noch bei der Probe waren. Das Bild, das dadurch entsteht, wird auch als reelles Zwischenbild bezeichnet – ein Bild, das zwar noch nicht zu sehen ist, aber in Form von Lichtstrahlen schon vorhanden ist. Das Okular bündelt die Lichtstrahlen zusammen, sodass sie vom Auge aufgenommen werden können. Der Winkel, in dem die Lichtstrahlen ins Auge fallen, sind dann der Grund für den vergrößerten Effekt, mit dem das Bild wahrgenommen wird. Was man sieht, ist das virtuelle Zwischenbild – die Strahlen treffen nicht in dieser Größe aufs Auge, es wird durch den Einfallwinkel aber eine vergrößerte Version des Bildes auf die Netzhaut projiziert.
Lichtmikroskope werden in der Medizin zum Beispiel oft zur Untersuchung von Blut oder Mikroorganismen verwendet. So können krankheitsauslösende Keime, wie Pilze oder Bakterien, nachgewiesen werden.
Auch für die Betrachtung von Pflanzenzellen in der Forschung sind Lichtmikroskope gut geeignet.
Elektronenmikroskopie
Anstelle von Lichtstrahlen nutzt das Elektronenmikroskop einen Elektronenstrahl, um das Präparat abzubilden. Da sich Elektronen rasant bewegen und eine kurze Wellenlänge haben, sind Elektronenmikroskope dazu fähig, Bilder mit höherer Auflösung zu generieren als Lichtmikroskope. Außerdem können sie dadurch winzige Strukturen abbilden.
Auch Elektronenmikroskope können in verschiedene Arten unterteilt werden. Transmissionselektronenmikroskope (TEM) durchstrahlen die Probe und sind dazu fähig, Strukturen in der Probe dazustellen, allerdings müssen die Präparate dafür in dünnen Schichten vorbereitet werden. Rasterelektronenmikroskope (REM/ SEM) scannen die Oberfläche der Probe ab. Das entstehende Bild wirkt wie eine dreidimensionale Darstellung der Probe. Hierfür können etwa Gesteinsproben oder kleinste Insekten genutzt werden.
Aufbau und Funktion des Elektronenmikroskops
Im Unterschied zu Lichtmikroskopen wird hierbei eine Elektronenquelle genutzt. Ein Elektronenmikroskop ist ein geschlossenes System, in dem ein Vakuum erzeugt wird, um die Elektronen nicht in ihrer Flugbahn zu stören. Der im Folgenden beschriebene Aufbau entspricht einem Transmissionselektronenmikroskop.
| Bestandteil | Funktion |
| Elektronenquelle | Gibt Elektronen aus einer Kathode frei, die zur Anode hin beschleunigt werden. Die Spannung zwischen Anode und Kathode bestimmt die Geschwindigkeit der Elektronen. |
| Elektronenlinse (Spule) | Fokussieren den Elektronenstrahl, Winkel ist dabei verstellbar. |
| Vakuumsystem | Erzeugt ein Vakuum und sorgt für ungestörten Flug der Elektronen (verhindert Störungen durch Staub oder Glas). |
| Probehalterung | Verstellbare Vorrichtung für stabile Lage der Probe. Verschiebung, Heizung und Kühlung sowie Dehnung und Drehung der Probehalterung sind möglich. |
| Detektoren | Sie registrieren die Elektronen oder sekundäre Signale. |
Das Elektronenmikroskop beschießt das Präparat mit Elektronen, die daraufhin verschiedene Signale abgeben können. Je nachdem, was für ein Elektronenmikroskop verwendet wird, entstehen dabei verschiedene Arten von Strahlungen, die als Signale aufgenommen und interpretiert werden können. Anders als im Lichtmikroskop nimmt der Betrachter dabei nicht direkt das Licht auf, das von der Probe reflektiert wird. Die detektierten Signale werden zunächst umgewandelt, bevor sie vom Betrachter – meist auf einem Computerbildschirm – als Bild wahrgenommen werden können.
In der Medizin werden Elektronenmikroskope oft zur Untersuchung von Viren und anderen Mikroorganismen verwendet, die für Lichtmikroskope zu klein sind.
Aber auch Zellinnenräume können durch das Elektronenmikroskop besser dargestellt werden. Veränderungen der Zellen aufgrund von Erregern lassen sich durch das Elektronenmikroskop gut feststellen.
Eine Vertiefung zu den Arten von Elektronenmikroskopen findest Du im StudySmarter-Artikel zur Elektronenmikroskopie.
Methoden der Zellbiologie: Methoden der Färbung
Um Zellen und Gewebestrukturen deutlich zu erkennen, nachzuweisen oder voneinander abzugrenzen, können Färbungen genutzt werden. Die genutzten Farbstoffe dringen nur in bestimmte Strukturen der Zelle ein – sind also selektiv – und markieren dadurch ihre Positionen. Auf diese Weise können diese Strukturen von anderen, nicht eingefärbten Zellbestandteilen unterschieden werden.
Funktionsweise einer Färbung
Farbstoffe setzen sich in gewünschten Zellstrukturen fest und interagieren mit Licht, sodass beim Betrachter der Eindruck einer Färbung entsteht. Normales Tageslicht wird auch als weißes Licht bezeichnet und enthält alle Wellenlängen des sichtbaren Farbspektrums. Farbstoffe können manche der im weißen Licht enthaltenen Wellenlängen absorbieren und andere zurückwerfen (reflektieren). Wenn eine eingefärbte Probe daher mit weißem Licht bestrahlt wird, entsteht der Eindruck, dass die betroffenen Strukturen mit einer bestimmten Farbe markiert sind.
Markierung durch Farbstoffe
Je nachdem, welche Strukturen eingefärbt werden sollen, können unterschiedliche Farbstoffe verwendet werden. Farbstoffe sind meist Moleküle, die bei einem bestimmten pH-Wert ihrer Umgebung dissoziieren können.
Wenn Moleküle dissoziieren, teilen sie sich in mindestens zwei Ionen (geladene Teilchen) auf. Wann diese Trennung stattfindet und welche Ionen dabei entstehen, hängt davon ab, wie sauer oder basisch der pH-Wert ihrer Umgebung gerade ist. Da eine saure Umgebung durch positiv geladene Teilchen und eine basische Umgebung durch mehr negativ geladene Teilchen entsteht, beeinflusst die Zusammensetzung der Lösung in einem Kompartiment, wann der Farbstoff dissoziiert.
Da jeder Farbstoff durch seinen atomaren Aufbau unterschiedliche Eigenschaften besitzt, können sich verschiedene Farbstoffe unterschiedlich gut durch die Kompartimente der Zelle bewegen und in einem davon dissoziieren. Die entstehenden Ionen setzen sich durch ihren geladenen Zustand an einer bestimmten Zellstruktur fest und markieren diese. Je nachdem welche Farbstoffe genutzt werden, können die Strukturen dann mit unterschiedlichen Arten von Mikroskopen sichtbar gemacht werden.
Neben den konventionellen Lichtmikroskopen gibt es auch Fluoreszenzmikroskope. Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird die Probe nur mit einer bestimmten Wellenlänge an Licht bestrahlt. In der Probe sind fluoreszierende Färbemittel (Fluorochrome) an den zu visualisierenden Strukturen befestigt, die das Licht absorbieren und mithilfe von Fluoreszenz wieder zurückstrahlen. Auf diese Weise kann die genaue Position der Fluorochrome und somit der markierten Strukturen bestimmt werden.
Arten von Farbstoffen
Farbstoffe können je nach Herkunft und Funktionsweise in verschiedene Arten unterteilt werden:
- Primärfarbstoffe/ natürliche Farbstoffe: Diese Farbstoffe sind natürlicherweise in der Zelle enthalten; dazu zählen beispielsweise Hämoglobin, das dem Blut seine rote Farbe verleiht oder Chlorophyll, das die Blätter grün erscheinen lässt.
- Sekundärfarbstoffe: Sekundäre Farbstoffe werden dem Objekt erst durch eine künstliche Färbung zugeführt. Es kommen oft natürliche Farbstoffe zum Einsatz, aber auch synthetisch hergestellte Farbstoffe können verwendet werden.
- Vitalfarbstoffe: Farbstoffe, die für Strukturen lebender Zellen verwendet werden.
- Fluoreszenz-Farbstoffe (Fluorochrome): Farbstoffe, die einfallendes Licht absorbieren und die Energie durch Fluoreszenz wieder ausstrahlen. Es wird ein Leuchteffekt erzielt.
Bei Laboruntersuchungen von Blut wird eine Pappenheim-Färbung für die Unterscheidung und Charakterisierung der verschiedenen Zellen des Immunsystems genutzt. Dabei wird ein Blutausstrich mit den Sekundärfarbstoffen versetzt. Die Immunzellen sollten im optimalen Fall unterschiedliche Farbtöne annehmen. Haben die Zellen abweichende Formen oder Farben, kann dies jeweils ein Hinweis auf eine Krankheit sein.
Verformte Erythrozyten sind etwa meist die Folge einer Sichelzellenanämie. Auch die Anteile der verschiedenen Immunzellen an der Gesamtzahl der Zellen kann untersucht werden, um Hinweise auf etwaige Krankheiten zu erhalten.
Einen tieferen Einblick zu den verschiedenen Färbungsmöglichkeiten in der Zelle erhältst Du in den StudySmarter-Artikeln zur Fluoreszenzmikroskopie und der histochemischen Färbung.
Fluoreszenz-Farbstoffe
Fluoreszenzmikroskope werden vor allem dann genutzt, wenn die zu lokalisierende Strukturen zu klein für ein konventionelles Lichtmikroskop sind oder wenn Interaktionen zwischen bestimmten Strukturen oder Proteinen untersucht werden sollen. Auch hierfür gibt es verschiedene Farbstoffe, die je nach Art des Experiments ausgewählt werden. Diese basieren vorwiegend darauf, wie die Fluorophore an ihren Zielstrukturen angebracht werden sollen.
Immunhistochemie
Eine der häufigsten Methoden zur Befestigung von Fluorophoren an Zellbestandteilen ist die Immunhistochemie. Dabei werden Antikörper verwendet, um Proteine oder Moleküle an bestimmte Strukturen zu binden.
Da Antikörper zwei sehr genaue Bindungsstellen besitzen, können sie genutzt werden, um Zellbestandteile spezifisch zu binden. Moleküle wie Fluorochrome werden am Antikörper befestigt, der die Zellstrukturen bindet, wodurch diese indirekt markiert werden.
Für diese Methode ist es allerdings notwendig, die Zelle zu fixieren und zu permeabilisieren. Die Probe wird daher zur Fixierung in ein Material eingebettet und die Zellwand durchlässig gemacht (permeabilisiert). Das ist nötig, damit die Antikörper überhaupt in die Zelle gelangen. Da Zellen mit einer zerstörten Zellwand lebensunfähig sind, ist diese Methode nicht geeignet, um lebende Zellen einzufärben.
Die folgende Abbildung zeigt einen mit verschiedenfarbigen Fluorochromen versetzten Rattendarm. Die einzelnen Zellen sind mit grün abgegrenzt, die Zellkerne erleuchten Cyanblau und eine besondere Zellsorte des Darms wurde Magenta markiert.
Abbildung 1: Fluoreszenzfärbung eines Rattendarms
Markierung lebender Zellen
Um lebende Zellen markieren zu können, werden andere Methoden genutzt. GFP (green fluorescent protein) ist ein fluoreszierendes Protein, dessen Gensequenz mithilfe gentechnischer Methoden in die DNA eines Organismus eingebracht werden kann. Wird diese Gensequenz an der richtigen Stelle eingebaut, kann der Organismus GFP selbst herstellen. Außerdem wird das GFP gemeinsam mit der Zielstruktur hergestellt, weshalb die beiden immer aneinander gekoppelt vorliegen.
Die lebenden Zellen können dann unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, wobei die Zielstrukturen genauestens lokalisiert werden können. Die Betrachtung der lebenden Zellen unter einem Mikroskop und der dabei entstehende Zeitraffer, der den Ablauf von Prozessen in der Zelle abbildet, wird auch als live-cell imaging bezeichnet.
Außer dem GFP gibt es inzwischen auch andere fluoreszierende Proteine, die in das Genom eines Organismus eingebracht werden können. Dazu zählen etwa rot (GFP), gelb (YFP) oder cyan (CFP) fluoreszierende Proteine. Diese können auch dafür genutzt werden, um herauszufinden, ob zwei bestimmte Proteine miteinander interagieren.
Nehmen wir an, ein*e Forscher*in will wissen, ob Protein A und Protein B etwas miteinander zu tun haben und interagieren. Die Sequenz eines YFP wird dazu in zwei geteilt und jeweils eine Hälfte neben die Sequenzen der Proteine A oder B in das Genom eingebracht. Bei der Herstellung der Proteine ist dann jeweils eine Hälfte des YFP an sie gekoppelt. Falls diese beiden Proteine miteinander interagieren, dann kommen sie sich sehr nah und bringen dabei auch die beiden Hälften des YFP in unmittelbare Nähe zueinander. In einem solchen Fall können die beiden Hälften wechselwirken und fangen an zu leuchten, als ob sie ein ganzes YFP wären. Das kann unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden und bestätigt zumindest, dass sich Protein A und B so nahe kommen, wie es für eine Interaktion notwendig wäre.
Methoden der Zellbiologie – Das Wichtigste
- Zu Methoden der Zellbiologie zählen Färbungen und die anschließenden Betrachtungen unter einem Mikroskop.
- Je nachdem welche Strukturen betrachtet werden sollen und welche Färbung verwendet wird, kann Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden.
- Elektronen- und Fluoreszenzmikroskope können kleinere Strukturen auflösen als konventionelle Lichtmikroskope.
- Die gewählte Methode muss dem Ziel und den Anforderungen des Experiments entsprechen: nicht alle Methoden können an lebenden Zellen durchgeführt werden.
- Es gibt verschiedenen Farbstoffarten: natürliche und Sekundärfarbstoffe sowie Fluoreszenz- und Vitalfarbstoffe
Nachweise
- lichtmikroskop.net: Wie funktioniert ein Mikroskop? (01.06.2022)
- Michael Volgger (2008). Färbung und Farbstoffe. univie.ac.at. (04.06.22)
- univie.ac.at: Fluoreszenz-Farbstoffe. (05.06.2022)
- Jürgen Klingaus (2009). Methoden der Zellbiologie: Lichtmikroskopie von Zellstruktur und Zellfunktion. medizin.uni-muenster.de (05.06.2022)
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