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Um verschiedene Bakterienarten besser unterscheiden und differenzieren zu können, hat der dänische Pathologe Hans-Christian Gram Ende des 19. Jahrhunderts die nach ihm benannte Gram-Färbung entwickelt. Diese Färbung hilft dabei, Unterschiede im Zellwandaufbau von Bakterien sichtbar zu machen. Man konnte so zum ersten Mal zwischen zwei großen, taxonomisch bedeutsamen Gruppen unterscheiden: den grampositiven und gramnegativen Bakterien.Auch heute noch ist die Gram-Färbung…
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Auch heute noch ist die Gram-Färbung der Goldstandard in der bakteriologischen Diagnostik und meistens eine der ersten Färbungen, die man an einem Präparat vornimmt. Durch diese Färbung kann man auch schon eine erste Entscheidung darüber treffen, welche Antibiotika man gegen die Bakterien verwenden kann und welche, aufgrund des Zellwandaufbaus, wirkungslos sein werden.
Die Gram-Färbung ist eine kombinierte Färbemethode. Das bedeutet, dass bei dieser Methode mindestens zwei verschiedene Farbstoffe verwendet werden.
Die Gram-Färbung färbt die Peptidoglykanstrukturen in einer Bakterienzellwand ein. Dabei sind zwei Ergebnisse möglich:
Grampositives Präparat
Wenn ein Präparat als grampositiv bezeichnet wird, hat diese Bakterienzelle ein dicke, mehrschichtige Peptidoglykanschicht (auch Mureinschicht genannt) und färbt sich deswegen blau/lila. Wenn sich ein Präparat nur teilweise blau färbt, wird es trotzdem grampositiv genannt. Grampositive Präparate erscheinen blauviolett und haben eine mehrschichtige Mureinschicht.Gramnegatives Präparat
Wenn ein Präparat gramnegativ ist, haben die Zellen eine dünne Mureinschicht (also eine oder wenige Schichten). Das Präparat wird sich rot färben. Gramnegative Präparate erscheinen rot.Nicht nur die Farbe des gramgefärbten Präparats ist wichtig, sondern auch auf die Morphologie der einzelnen Bakterien. Dies ist ein optimales Kriterium, um auf eine bestimmte Bakteriengruppe schließen zu können. Sind sie eher ketten-, kugel- (in der Fachliteratur Kokken genannt) oder doch keulenförmige (coryneforme) Bakterien? Die Morphologie der Bakterien ist vielfältig und hilft bei der Diagnosefindung.
Hier folgt nun ein kurzer Exkurs über den Aufbau von Bakterienzellwänden, der dir helfen wird, die Gram-Färbung besser zu verstehen.
Grampositive Zellwände sind einfach aufgebaut:
Im Inneren umschließen sie das Zytoplasma mit einer Cytoplasmamembran, die aus einer doppelten Phospholipid Schicht besteht. Direkt nach außen angeschlossen befindet sich eine dicke Mureinschicht. Dieses Peptidoglykan kann aus bis zu 40 Schichten bestehen.
Zusätzlich sind in der Zellwand neben anderen Proteinen noch Teichonsäuren und Lipoteichonsäuren eingebaut. Sie sind unterschiedlich tief in der Zellwand verankert (Lipoteichonsäuren ragen weiter in die Zellwand als Teichonsäuren).
Diese beiden Säuren sind spezifisch für grampositive Bakterien. Die Abwehrzellen des Körpers haben sogar einen eigenen Rezeptor zur Erkennung dieser Säuren. Dadurch kann die angeborene Immunantwort gut grampositive Bakterien bekämpfen.
Grampositive Bakterien sind unter anderem:
Gramnegative Zellwände sehen etwas komplizierter aus:
Innen umschließen sie, wie grampositive Bakterien, das Zytoplasma mit einer Doppel-Phospholipid Schicht. Darauf folgt das einschichtige (oder nur sehr wenige Schichten umfassende) Murein.
Zusätzlich haben gramnegative Bakterien noch eine äußere, asymmetrische Membran, die zu einem großen Teil wieder aus einer Phospholipidschicht besteht. Dazwischen liegt ein periplasmatischer Spalt, der von mehreren Murein-Lipo-Proteinen überbrückt wird. Diese Proteine verbinden so die äußere Membran und das Murein.
Ganz außen an der äußeren Membran, an der Oberfläche des gramnegativen Bakteriums, sitzen mehrere Lipopolysaccharidstrukturen auf. Diese sind spezifisch für gramnegative Bakterien und können durch die Toll-like-Rezeptoren erkannt werden.
Gramnegative Bakterien sind unter anderem:
Säurefeste Bakterien besitzen eigentlich ein mehrschichtiges Murein. Allerdings besitzen sie im Gegensatz zu grampositiven Bakterien zusätzlich noch eine äußere, wachsartige Schicht. Diese besteht aus Mykolsäuren und Lipiden und sorgt für die Säurefestigkeit der Bakterien. Die Farben der Gram-Färbung können diese Schicht nicht durchdringen.
Das Murein und die äußere Schicht sind durch ein Polysaccharid (genauer: Arabinogalactan) verbunden.
Abbildung 1: Schematischer Aufbau der Zellwand säurefester Bakterien
Eine Gram-Färbung ist einfach und kostengünstig herzustellen. Nachdem die kultivierten Bakterien auf einem Objektträger ausgestrichen und mit Hitze fixiert werden, sind es im Wesentlichen nur noch vier Schritte:
Erst wird das Präparat mit einem blauvioletten Farbton gefärbt. Es wird unter anderem häufig Gentianaviolett oder Kristallviolett dafür verwendet.
Das Präparat wird danach mit Lugol’scher Lösung gebeizt. Da Lugol’sche Lösung jodhaltig ist, bildet sich ein Jod-Farbstoff-Komplex aus. Durch diesen Komplex ist der Farbstoff nicht mehr wasserlöslich. Das Präparat kann nun nur noch mit Alkohol entfärbt werden und nicht (aus Versehen) mit Wasser.
Jetzt kommt der wichtigste Schritt, denn hier wird nun zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien differenziert. Man entfärbt mit Alkohol das Präparat (wenn man den Alkohol mit etwas Aceton anreichert, läuft der Prozess noch schneller ab).
Zum Schluss wird das Präparat mit einem roten Farbstoff (zum Beispiel Fuchsin) gefärbt. So erscheinen auch die gramnegativen Bakterien nicht mehr farblos und man kann sie unter dem Mikroskop besser beurteilen.
Es gibt aber auch Präparate, die sich mittels einer Gram-Färbung nicht anfärben lassen. Solange das Präparat richtig angefärbt wurde, besteht kein Problem. Es gibt nämlich auch gramlabile Bakterien, die nach einer Gram-Färbung weiterhin farblos erscheinen.
Mehrere Gründe sind dafür verantwortlich, dass sich diese Bakterien nicht mit einer normalen Gram-Färbung anfärben lassen. Die zwei wichtigsten sind:
Es gibt einige Bakterien, die gar keine Zellwand besitzen. Ohne Zellwand gibt es auch keine Mureinschicht, die gefärbt werden könnte. Das Präparat bleibt ungefärbt. Ein Beispiel hierfür sind die Mykoplasmen.
Andere Bakterien wiederum haben eine spezielle, wachsartige, säurefeste äußere Schicht in ihren Zellwänden entwickelt. Auch so kann sich kein Farbstoff festsetzen und das Präparat färben. Es bleibt wieder farblos in der Gram-Färbung.
Ein Beispiel hierfür sind Mykobakterien, die unter anderem Tuberkulose verursachen können.
Sollen säurefeste Bakterienzellwände gefärbt werden, benötigt man Spezialfärbungen.
Bei den Mykobakterien kommt hier die Ziehl-Neelsen-Färbung zum Einsatz. Dabei wird erst – entweder durch Hitze oder enzymatisch – die äußere, säurefeste Hülle aufgeschmolzen oder aufgespalten (je nach Methode). Danach kann man die Zelle mit einer roten Farbe (zum Beispiel Fuchsinrot) anfärben und danach noch einmal gegenfärben, zum Beispiel mit einem blauen Farbton.
Färbt man Bakterien mithilfe der Gram-Färbung, so können diese sich grampositiv oder gramnegativ darstellen. Grampositiv bedeutet, dass die angefärbten Bakterien eine dicke Mureinschicht aufweisen. In der dicken Mureinschicht bleibt der Farbstoff Kristallviolett auch nach der Behandlung mit Alkohol eingelagert. Daher erscheinen grampositive Bakterien unter dem Lichtmikroskop blauviolett. Gramnegative Bakterien hingegen besitzen nur eine dünne Mureinschicht. Mit Alkohol wird das Kristallviolett ausgewaschen und die Bakterien können z. B. mit dem Farbstoff Fuchsin gegengefärbt werden. Sie erscheinen daher rot.
Gramnegative Bakterien färben sich bei der Gram-Färbung rot an. Das liegt daran, dass ihre dünne Mureinschicht nach der Behandlung mit Kristallviolett durch Alkohol wieder entfärbt werden kann. Nach der Gegenfärbung mit einem roten Farbstoff wie Fuchsin stellen sie sich unter dem Lichtmikroskop rot dar.
Die Gram-Färbung umfasst im Wesentlichen vier Schritte:
Ein gramnegatives Bakterium besitzt eine dünne Mureinschicht und stellt sich daher in der Gram-Färbung rot dar. Zu gramnegativen Bakterien zählen z. B.:
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