In der Zellbiologie müssen oft nur ganz bestimmte Teile der Zelle untersucht werden. Will man diese Teile visualisieren – beipielsweise unter einem Mikroskop – ist es oft schwer, zwischen ihnen und anderen Zellbestandteilen zu unterscheiden. Um die Untersuchung zu vereinfachen, können daher Fluoreszenzfärbungen genutzt werden.
Durch Fluoreszenzfärbungen werden bestimmte Strukturen der Zelle an fluoreszierende Moleküle gebunden. Damit können die Positionen dieser Strukturen klar markiert werden.
Fluoreszenzfärbung – Prinzip
Bei solchen Färbungen werden Stoffe oder Moleküle genutzt, die zur Fluoreszenz fähig sind. Durch Bestrahlung mit Licht können diese Moleküle dazu gebracht werden, zu fluoreszieren. Die Fluoreszenz kann dann in einem Mikroskopiebild oder auch mithilfe anderer Detektoren sichtbar gemacht werden.
Fluoreszenz Erklärung
Um das Prinzip von Fluoreszenz zu verstehen, ist es wichtig, dass du zunächst ein grundlegendes Verständnis für die Eigenschaften von Licht hast.
Licht ist eine Welle
Licht ist eine elektromagnetische Welle und hat daher – wie jede Welle – auch eine Wellenlänge.
Die Wellenlänge beschreibt die Entfernung zwischen den zwei Maxima einer Welle.
Wenn sich die Wellenlänge von Licht zwischen etwa 380 nm und 780 nm befindet, zählt es in den Bereich des sichtbaren Lichts. Sichtbares Licht kann dann – wie es der Name schon verrät – von unseren Augen wahrgenommen und von unserem Hirn als eine Farbe interpretiert werden.
Doch nicht nur die Farbe eines Lichtstrahls ist von seiner Wellenlänge abhängig, sondern auch seine Energie.
Stell dir vor, du hast ein langes Seil vor dir und nimmst das eine Ende in die Hand.
Jetzt fängst du an, dieses Ende hin und her zu schwingen. Die Bewegung überträgt sich auf das Seil und Wellen fangen an, sich durch das Seil zu bewegen.
Das sind dir aber nicht genug Wellen und du fängst an, deinen Arm schneller und schneller zu bewegen. Die Länge der Wellen, die du im Seil siehst, ist jetzt kürzer, weil auf die immer gleich bleibende Länge des Seils eine größere Anzahl an Wellen passen muss. Du merkst aber auch, wie deine Arme immer müder werden, denn es kostet dich mehr Energie, die vielen, kleinen Wellen ins Seil zu übertragen.
Auf diese Weise ist in den kleineren Wellenlängen eine höhere Energie gespeichert.
Die Energie des Lichts steigt also mit einer niedrigen Wellenlänge und sinkt mit einer höheren Wellenlänge.
Fluoreszenz Definition
Fluoreszenz beschreibt ein Phänomen, bei dem ein Stoff oder ein Molekül zunächst mithilfe von Lichtenergie angeregt wird, bevor diese Energie spontan und in Lichtform wieder abgegeben wird.
Das einfallende Licht wird vom Molekül absorbiert – also aufgenommen – und kann dabei ein Elektron des Moleküls anregen. Dieses hat dadurch eine höhere Energie als vorher und befindet sich nicht mehr in seinem entspannten Grundzustand.
Um wieder dorthin zurückzukehren, gibt das Elektron diese Energie wieder ab – in einem Prozess, der auch als Emission bezeichnet wird.
Absorption: Aufnahme von Licht
Emission: Abgabe von Licht
Bevor Licht emittiert werden kann, geht auch ein wenig der Energie verloren, die auf das Elektron übertragen wurde. Daher hat das emittierte Licht in der Regel eine höhere Wellenlänge als das absorbierte Licht. Die Farbe des Lichts, mit dem das Molekül angeregt wird, ist deshalb eine andere als die Farbe, die als Fluoreszenz sichtbar wird.
Fluoreszenzfärbung – Fluoreszenzmikroskopie
Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle Art der Mikroskopie, bei der Fluoreszenzfärbemittel mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden.
Fluoreszenzmikroskope funktionieren durch das Grundprinzip der Lichtmikroskopie. Falls du dein Wissen zu Lichtmikroskopen noch einmal auffrischen willst, schau doch mal im entsprechenden Artikel vorbei!
Fluoreszenzfärbemittel
Fluoreszierende Färbemittel können verwendet werden, um gezielt an bestimmte Strukturen einer Probe gebunden zu werden und diese somit zu markieren. Sie werden auch als Fluorochrome bezeichnet.
Fluorochrome haben klar definierte Wellenlängen, die sie absorbieren können und Wellenlängen, die sie emittieren. Das macht ihre Verwendung einfach, da sie dadurch gut voneinander unterscheidbar sind, wenn mehrere von ihnen in derselben Probe verwendet werden.
Fluoreszente Färbemittel können teilweise schon in der Natur vorkommen, während andere speziell für den Zweck der Fluoreszenzfärbung entwickelt wurden.
Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops
Ein typisches Fluoreszenzmikroskop ist zum Beispiel das Epifluoreszenzmikroskop.
In einem Fluoreszenzmikroskop wird ausgenutzt, dass ein Fluorochrom nur mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden kann. Dafür gibt es zwei Möglichkeiten:
Es kann ein Laser genutzt werden, der die Probe unter dem Mikroskop beleuchtet. Da Laser nur Licht einer bestimmten Wellenlänge aussenden, sind sie perfekt, um Fluorochrome zu aktivieren.
Eine andere Möglichkeit ist die Nutzung von Filtern. Man bestrahlt die Probe mit einer Lampe und kann mithilfe der Filter unerwünschte Wellenlängen einfach zurückhalten. Damit erreichen nur jene Wellenlängen die Probe, die das Fluorochrom auch aktivieren können.
Ist ein Fluorochrom aktiviert, emittiert es Licht mit einer höheren Wellenlänge als das Licht, mit dem es aktiviert wurde.
Mit der Nutzung von Strahlteilern kann man sich diesen Effekt zunutze machen:
Strahlteiler sind für manche Wellenlängen durchlässig, während andere Wellenlängen daran reflektiert werden. Auf diese Weise kann das Licht für die Aktivierung auf die Probe gelenkt werden, während das emittierte Licht auf einen Detektor geleitet wird.
Auf dem entstehenden Bild sieht kann man nun alle Strukturen sehen, die vorher durch die Fluoreszenzfärbung markiert wurden.
Viele Epifluoreszenzmikroskope sind mit einer Software verbunden, die mehrere aufgenommene Bilder derselben Stelle in der Probe kombinieren kann. Dadurch ist es möglich, die Aufnahmen verschiedener Fluorochrome, die unterschiedliche Strukturen markieren, über ein lichtmikroskopisch aufgenommenes Bild zu legen und dort somit genau zu markieren, wo sich was befindet.
Fluoreszenzfärbung Verwendung
Während Fluoreszenzmikroskopie nur eine Methode ist, Fluoreszenzfärbungen visuell darszustellen, gibt es mehrere Bereiche in der Biologie, in denen eine Fluoreszenzfärbung angewendet werden kann.
Die dabei verwendeten Methoden unterscheiden sich meist darin, welche Fluorochrome verwendet werden und ob oder wie diese an den Zielstrukturen befestigt werden, die untersucht werden sollen.
Fluoreszenzfärbung der DNA
Die DNA der Zelle muss für viele Methoden der Biologie eingefärbt werden. Trennt man zum Beispiel per Gelelektrophorese mehrere DNA-Fragmente ihrer Größe nach auf, müssen sie vorher markiert werden, um später im Gel sichtbar gemacht werden zu können. Auch für viele Methoden zur Sequenzierung eines DNA-Stranges wird eine Fluoreszenzfärbung benötigt.
Falls du dich zunächst näher über Methoden informieren willst, die eine markierte DNA benötigen – z.B. die Gelelektrophorese oder die Sanger-Sequenzierung – dann schau doch mal unter den Artikeln zur Sequenzanalyse vorbei!
Gelelektrophorese
Bei einer Gelelektrophorese werden DNA-Fragmente ihrer Größe nach auf einem Gel aufgereiht. Ihre Größe lässt sich dann anhand eines Größenmarkers ganz einfach ablesen.
Für eine Gelelektrophorese werden Farbstoffe wie zum Beispiel Ethidiumbromid in das Gel oder direkt zur DNA gegeben. Das Ethidiumbromid ist dann dazu fähig, in die DNA zu interkalieren.
Bei einer Interkalation lagert sich ein Molekül einfach in den Doppelstrang der DNA ein.
Wird das Gel nach der Auftrennung der DNA mit UV-Licht beleuchtet, erstrahlt das Ethidiumbromid sehr stark, da es aufgrund der Einlagerung zu verschiedenen Wechselwirkungen mit der DNA kommt. Diese Fluoreszenz kann mit einem Foto aufgenommen werden, sodass genau zu sehen ist, wo sich auf dem Gel DNA-Fragmente befinden. Über diese Information ist es schließlich möglich, auf die Größe der DNA-Fragmente rückzuschließen.
DNA Sequenzierung
Die wohl bekannteste Methode zur Sequenzierung der DNA ist die Sanger-Sequenzierung.
Bei der Sanger-Sequenzierung werden DNA-Stränge repliziert und dabei zufällig abgebrochen. Je nach Größe werden die neu synthetisierten Stränge dann aufgeteilt, um die Sequenz des Stranges ablesen zu können.
Für den Abbruch werden speziell modifizierte Bausteine verwendet, die unter anderem an fluoreszierende Färbemittel gekoppelt sind. Mithilfe eines Lasers und eines Detektors können diese Färbemittel dann abgelesen werden. Da verschiedene Bauteile der DNA mit verschiedenen Farben markiert sind, kann durch das Ablesen der Fluoreszenz die Sequenz der DNA ermittelt werden.
In-situ Hybridisierung
Eine weitere Methode zur fluoreszenten Markierung der DNA ist die in-situ Hybridisierung.
In-situ Hybridisierungen werden genutzt, um bestimmte DNA-Abschnitte im Genom einer Zelle zu lokalisieren, oder um zu überprüfen, ob eine bestimmte DNA-Sequenz im Genom vorhanden ist.
Dabei können sich die Zellen, die untersucht werden, noch im Organismus – oder Teilen davon – befinden.
Das Fluorochrom ist an einem DNA-Fragment befestigt, das komplementär zu einem DNA-Abschnitt ist, der sich auf jeden Fall im Genom des Organismus befindet oder befinden könnte (je nachdem, was das Ziel des Experiments ist).
Dieses Konstrukt bildet eine sogenannte DNA-Sonde und kann an den entsprechenden DNA-Abschnitt in der Zelle binden. Auf diese Weise ist es möglich, einen spezifischen DNA-Abschnitt zu markieren, von dem man beispielsweise nicht weiß, ob er überhaupt im Organismus vorhanden ist oder nicht.
Diese Methode kann auch dafür verwendet werden, Zellkerne zu markieren, wie es in den oben genannten Methoden auch schon getan wurde.
Eine andere Anwendung der in-situ Hybridisierung ist die Suche nach der Lokalisation eines bestimmten Gen-Abschnitts. Wird die Zelle während des richtigen Stadiums der Zellteilung fixiert, kann ermittelt werden, in welchem Chromosom sich ein bestimmtes Gen befindet.
Unter einem Fluoreszenzmikroskop kann dann sichtbar gemacht werden, ob und wo ein DNA-Abschnitt markiert wurde.
Einfärbung zur mikroskopischen Untersuchung
Im Rahmen der Histologie müssen oft müssen ganze Zellen unter dem Mikroskop untersucht werden.
Histologie beschreibt die Untersuchung von dünnen Gewebeproben, die entweder tierischen oder pflanzlichen Geweben entstammen.
Aufgrund der vielen Organellen innerhalb der Zelle und der Auflösungsgrenze von normalen Lichtmikroskopen ist die genaue Identifizierung einer Struktur jedoch nicht immer möglich.
Durch die Welleneigenschaft des Lichts ist sogar die Auflösung unter einem Mikroskop beschränkt. Diese sogenannte Auflösungsgrenze (oder auch Abbe-Limit) beschreibt den Abstand zwischen zwei Punkten, der mindestens gegeben sein muss, um diese zwei Punkte unterscheiden zu können und sie nicht als einen Punkt zu sehen. Gängige Lichtmikroskope sind nicht dazu fähig, Punkte zu unterscheiden, deren Abstand kleiner als etwa 300 nm ist.
Um dieses Problem zu umgehen, wurden inzwischen Superresolution-Mikroskope entwickelt. Diese Mikroskope nutzen Fluorochrome, die in der Probe verteilt sind, und nehmen ihre Positionen auf während sie die Probe nach und nach abscannen. Auf diese Art und Weise können Strukturen visualisiert werden, die viel kleiner sind, als die Auflösungsgrenze. Auch 3D-Aufnahmen sind mit verschiedenen Superresolution-Mikroskopen mittlerweile möglich.
Durch die Markierung der gewollten Strukturen mit Fluorochromen ist klar, wo genau sich diese befinden. Auch Vergleiche zwischen zwei Zellen sind möglich, wenn man zum Beispiel Unterschiede zwischen ihnen untersuchen will.
Der Farbstoff DAPI wird oft genutzt, um Zellkerne einzufärben. Er kann ebenfalls an die DNA binden und da sich die DNA normalerweise in einem Zellkern befindet, wird auf Bildern klar, welche Bereiche der Zelle zum Zellkern gehören.
Fluoreszenzfärbung verschiedener Zellbestandteile
Die roten Färbungen in Abbildung 2 markieren das Strukturprotein Aktin, welches ein Bestandteil des Zytoskeletts ist und die Zelle stabilisiert.
Näheres über Aktin kannst Du in der Erklärung zum Cytoskelett nachlesen!
Die Fluoreszenzfärbung des Aktins wurde durch den Stoff Texas Red X-Phalloidin verwirklicht. Phalloidin ist ein Toxin, das in der Natur im Grünen Knollenblätterpilz zu finden ist und an ein Bestandteil des Aktins bindet. Es ist an den fluoreszenten Stoff Texas Red X gekoppelt, weshalb dieses Fluorochrom gut zur Markierung des Aktins in der Zelle genutzt werden kann.
Eine andere Art der Fluoreszenzfärbung wurde mithilfe des Stoffs durchgeführt, der in Abbildung 2 grün fluoresziert. Diese Färbung markiert das Vorkommen des Proteins SRF (Serum response factor), welcher im Zellkern zu finden ist. Dieses Protein wurde zunächst mit einem Antikörper gekoppelt, der nur an dieses spezifische Protein binden kann. Dieser Antikörper wird auch als Primärantikörper bezeichnet.
Falls du wissen willst, was Antikörper genau sind und wieso sie so spezifisch sind, dass sie nur an bestimmte Strukturen binden können, dann schau doch mal bei den B-Zellen vorbei!
Ein zweiter Antikörper – der sogenannte Sekundärantikörper – kann nun an den ersten Antikörper binden. Der Sekundärantikörper ist bereits an ein GFP gekoppelt. GFP (Green fluorescent protein) ist ebenfalls ein Protein, das in der Natur zu finden ist, in diesem Fall in Quallen. Durch die Koppelung an Antikörper ist das GFP indirekt an das Protein SRF gebunden und markiert sein Vorkommen.
GFP kann nicht nur durch Antikörper an eine Zielstruktur gekoppelt werden. Es ist als fluoreszierender Marker in der Biologie sehr beliebt, weil seine DNA-Sequenz relativ einfach in die DNA verschiedener Organismen eingebracht werden kann. Befindet sich die GFP-Sequenz direkt hinter der Sequenz eines Proteins, das markiert werden soll, dann können beide Proteine – Zielprotein und GFP – direkt hintereinander abgelesen und aufgebaut werden.
Dadurch ist das GFP an das Zielprotein gekoppelt, ohne dass dafür noch zusätzliche Methoden nötig sind. Die Translation des Zielproteins reicht, um es zu markieren. Die Position oder das Vorkommen des Zielproteins kann anschließend unter einem Fluoreszenzmikroskop ermittelt werden.
Die Markierung von Proteinen durch Antikörper-gekoppeltes GFP wird nicht nur für die Mikroskopie verwendet. Bei einem Western Blot muss zum Beispiel sichtbar gemacht werden, ob sich bestimmte Proteine in einer Probe befinden.
Ein Western Blot wird dafür genutzt, um Proteine – die zuvor per Elektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt wurden – auf eine Membran aufgetragen. Durch verschiedene Methoden lässt sich dann ihre Position auf der Membran und somit ihre Größe feststellen.
Durch Einlegen der Membran in Primär- und Sekundärantikörper, können diese an die Proteine binden und dabei Marker – zum Beispiel GFP – an das Protein koppeln.
Unter einem Detektor kann das GFP zum fluoreszieren gebracht werden, wodurch sich auf die Größe und das Vorkommen des Zielproteins schließen lässt.
Methoden zur fluoreszenten Markierung einer zellulären Struktur:
- Fluorochrom interkaliert mit der DNA
- Fluorochrom ist an ein Toxin gebunden (oder an ein anderes Molekül, das mit der Struktur interagiert)
- Fluorochrom wird an sekundären Antikörper gekoppelt, der an einen primären Antikörper bindet, der an die Struktur bindet (Immunofluoreszenz)
- Fluorochrom wird durch Einbringen der Sequenz in die DNA des Organismus direkt an die Struktur gekoppelt
Fluoreszenzfärbung von Bakterien
Bakterien sind unter dem Mikroskop oft nicht von anderen Partikeln unterscheidbar, die sich in derselben Probe befinden, da sie keine sehr komplexe Struktur haben. Um sie daher eindeutiger identifizieren zu können, werden Bakterien mithilfe einer Fluoreszenzfärbung markiert.
Dafür können zum Beispiel Farbstoffe genutzt werden, die DNA-Stränge markieren.
Da Bakterien keinen extra abgetrennten Bereich besitzen, in dem sich die DNA befindet, wird die ganze Bakterien-Zelle mit angefärbt, wenn auch nur ein DNA-Farbstoff verwendet wird.
Ein dafür beliebter Farbstoff ist zum Beispiel Acridinorange. Er interkaliert in die DNA und lässt die Bakterien dadurch orange erstrahlen. Natürlich kann dieser Farbstoff auch für tierische oder pflanzliche Zellen verwendet werden und nicht exklusiv für Bakterien.
Fluoreszenzfärbung – Das Wichtigste
- Fluoreszenz beschreibt die Abgabe von Energie in Lichtform, nachdem ein Molekül durch Licht einer höheren Energie angeregt wurde
- Fluoreszenzmikroskope können Fluorochrome anregen und ihr emittiertes Licht detektieren, indem sie Licht einer bestimmten Wellenlänge auf die Probe lenken
- Die Markierung von Proteinen, DNA oder verschiedenen Zellbestandteilen durch fluoreszierende Stoffe ermöglicht es, gesuchte Strukturen unter dem Mikroskop genau zu lokalisieren
- Methoden wie Elektrophoresen oder Sequenzierungen benötigen fluoreszent markierte DNA-Fragmente oder Proteine, um Rückschlüsse auf ihre Größe oder Reihenfolge zu ziehen
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