RT PCR

Was ist eine RT PCR? Einfach erklärt

Als eine Weiterentwicklung der herkömmlichen PCR nutzt die RT PCR die Enzyme Reverse Transkriptase und DNA-Polymerase. Sie besteht im Wesentlichen aus zwei Phasen: die Reverse-Transkription, bei der RNA in DNA umgeschrieben wird, und die Amplifikation dieser DNA durch die PCR.

• Reverse Transkriptase: Dieses Enzym ist in der Lage, aus einer RNA-Matrize eine komplementäre DNA (cDNA) zu synthesieren. Dieser Prozess wird als Reverse Transkription bezeichnet.
• DNA-Polymerase: Dieses Enzym wird in der PCR-Phase verwendet, um die cDNA zu amplifizieren. Es repliziert die DNA-Stränge und erzeugt so millionenfache Kopien der Ziel-DNA.

Für eine erfolgreiche RT PCR benötigt du spezielle Reagenzien und Ausrüstungen:

• Primer: Kurze DNA-Fragmente, die sich an die Enden der Ziel-DNA binden und den Startpunkt für die DNA-Polymerase bilden.
• Thermocycler: Ein Gerät, das die Temperatur während der PCR-Zyklen präzise reguliert.

Der Zusammenhang zwischen RT PCR und MFA

Die RT PCR ist ein grundlegendes Werkzeug in der MFA (Molecular Forensic Analysis). MFA nutzt molekulare Techniken wie die RT PCR, um genetische Informationen aus forensischen Proben zu extrahieren und zu interpretieren.

MFA ist eine wichtige Disziplin in der kriminaltechnischen Untersuchung, die genetische Informationen zur Identifizierung von Individuen oder zur Klärung der Umstände verwendet, unter denen ein bestimmter Vorfall stattfand.

Die Anwendung von RT PCR in der MFA eröffnet enorme Möglichkeiten, vom genetischen Fingerabdruck bis zur Analyse von DNA-Mischspuren. Die Fähigkeit, tiny Mengen von genetischem Material zu erkennen und zu analysieren, macht sie zu einem leistungsstarken Werkzeug für forensische Ermittler.

Anleitung zur Durchführung einer RT PCR

Die Durchführung einer RT PCR umfasst verschiedene Schritte, die einen ordnungsgemäßen Ablauf und einen verlässlichen Nachweis der Ziel-DNA ermöglichen. Dabei ist es wichtig, bestimmte Besonderheiten und Techniken im Umgang mit dem Laborgerät, den Reagenzien und den Proben selbst zu beachten.

RT PCR durchführen: Schritt-für-Schritt Anleitung

Zunächst musst du das Reagenzgemisch vorbereiten. Dieses beinhaltet:

• Wasser
• dNTPs (Nukleotide)
• MgCl2 (Magnesiumchlorid)
• RNAse Inhibitor
• Reverse Transkriptase
• Taq-Polymerase
• Primer
• und die RNA Probe

Die genauen Mengen variieren je nach Kit und Experiment, daher ist es wichtig, den Anweisungen des Herstellers genau zu folgen. Das Reagenzgemisch und die Proben werden dann in den Thermocycler geladen, der die Temperaturzyklen steuert. Diese bestehen aus den folgenden Phasen:

Diese Zyklen werden mehrfach wiederholt (typischerweise 30-40 Mal), danach folgt eine Endverlängerungsphase. Jeder dieser Schritte hat eine spezifische funktionelle Bedeutung. Die anfängliche Denaturierung und die Denaturierung trennen die zwei DNA-Stränge voneinander, sodass die Primer binden können. Bei der Annealing-Temperatur binden die Primer an die Ziel-DNA. Während der Erweiterung (Elongation) synthetisiert die Taq-Polymerase neue DNA-Stränge.

Besonderheitsmerkmale beim RT PCR Ablauf

Obwohl die grundlegenden Schritte der RT PCR denjenigen der traditionellen PCR ähneln, gibt es einige Besonderheiten. Erstens, im Gegensatz zur traditionellen PCR, die mit DNA startet, beginnt die RT-PCR mit RNA. Dies bedeutet, dass ein zusätzlicher Schritt - die Reverse Transkription - erforderlich ist, um DNA aus der RNA zu synthetisieren. Dies geschieht vor der PCR-Amplifikation und erfordert das Enzym Reverse Transkriptase. Zweitens, die RT PCR ist quantitativ. Sie kann nicht nur das Vorhandensein einer spezifischen DNA-Sequenz nachweisen, sondern auch deren Menge bestimmen.

Dies wird durch Messung der Fluoreszenzintensität während jedem Zyklus erreicht. Je höher die Anfangsmenge der Ziel-DNA, desto schneller wird eine signifikante Menge an Produkt generiert und detektiert. Außerdem sollte beachtet werden, dass während der annealing phase die Temperatur und die Länge der Verlängerung abhängig ist von der Länge und der Sequenz der Primer, und daher für jedes Experiment spezifisch optimiert werden muss. Es ist auch wichtig zu beachten, dass RT PCR anfällig für Kontamination ist, da selbst eine kleine Menge DNA die Ergebnisse stark beeinflussen kann. Daher sind Sauberkeit und Sorgfalt bei der Vorbereitung und Durchführung von RT PCR entscheidend.

Analysieren der RT PCR Ergebnisse

Nachdem die RT PCR durchgeführt wurde, ist es entscheidend, die Ergebnisse korrekt zu analysieren und auszuwerten. Diese Analyse umfasst nicht nur die Bestätigung des Vorhandenseins oder Fehlens der Ziel-DNA, sondern auch ihre Quantifizierung. Denn die RT PCR ist ein quantitatives Verfahren.

RT PCR Auswertung: Interpretation der Ergebnisse

Die Auswertung des RT PCR-Tests beginnt mit der Begutachtung der sogenannten Amplifikationskurven. Bei der Amplifikationskurve handelt es sich um ein Diagramm, das die Veränderung der Fluoreszenzintensität (auf der y-Achse) im Verlauf der Zyklen der PCR-Reaktion (auf der x-Achse) darstellt. In der Regel gibt es eine Schwelle ("threshold"), oberhalb derer das Signal als "positiv" betrachtet wird. Die Anzahl der Zyklen, bis diese Schwelle erreicht wird, nennt man Ct-Wert (cyclus Threshold). Ein positives Ergebnis in einem RT-PCR-Test wird durch das Erreichen dieser Fluoreszenzschwelle innerhalb einer bestimmten Anzahl von Zyklen angezeigt.

Die genaue Zykluszahl, bei der das Signal die Schwelle erreicht, hängt von der Menge der Ziel-DNA in der Ausgangsprobe ab. Ein niedriger Ct-Wert (also eine geringe Anzahl von Zyklen bis zur Schwellenüberschreitung) deutet auf eine hohe Anfangsmenge des Zielmoleküls hin und umgekehrt. Es ist wichtig, dabei positive und negative Kontrollenzu verwenden, um sicherzustellen, dass die RT PCR korrekt funktioniert hat. Eine positive Kontrolle sollte immer die Schwelle erreichen, da sie das Zielmolekül in ausreichender Menge enthält. Eine negative Kontrolle hingegen sollte die Fluoreszenzschwelle nicht überschreiten, da sie kein Zielmolekül enthält. Darüber hinaus können auch Melt Curve Analysen durchgeführt werden, um spezifischere Informationen über die Amplifikationsprodukte zu erhalten.

Um die Daten korrekt zu interpretieren, ist Folgendes zu beachten:

• Eine positive Probe zeigt eine klare Amplifikationskurve, die die Schwelle überschreitet. Der Ct-Wert wird dokumentiert.
• Eine negative Probe zeigt keine erkennbare Amplifikationskurve. Es gibt keinen Ct-Wert, da die Schwelle nicht überschritten wurde.
• Eine positive Kontrolle sollte immer eine klare Amplifikationskurve zeigen, um die erfolgreiche Durchführung der RT PCR zu bestätigen.
• Eine negative Kontrolle sollte niemals eine Amplifikationskurve zeigen. Wenn sie dies tut, könnte dies auf eine Kontamination hinweisen.

Was bedeutet RT PCR quantitativ?

Die RT PCR ist eine quantitative Methode, das heißt, sie ermöglicht es, die Mengeder Ziel-DNA in der Ausgangsprobe zu bestimmen. Dies wird durch Messung der Fluoreszenzintensität während jedem Zyklus erreicht, denn je höher die Anfangsmenge der Ziel-DNA, desto schneller wird ein signifikantes Signal (also die Überschreitung der Schwelle) generiert und detektiert. Die Quantifizierung erfolgt anhand des Ct-Werts. Ein niedriger Ct-Wert weist auf eine hohe Ausgangsmenge der Ziel-DNA hin, während ein hoher Ct-Wert auf eine geringe Ausgangsmenge hindeutet.

In manchen Fällen kann es notwendig sein, die Ct-Werte zu normalisieren, z.B. indem man sie mit denen einer Referenzgenprobe vergleicht. Dadurch können variationsbedingte Unterschiede zwischen Proben ausgeglichen und somit vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Interpretation von Ct-Werten vorsichtig erfolgen sollte. Während niedrigere Ct-Werte im Allgemeinen auf eine höhere Menge an Ziel-DNA hinweisen, können sie in manchen Fällen auch das Ergebnis von experimentellen oder methodischen Variationen sein. Umgekehrt können hohe Ct-Werte bedeuten, dass die Ausgangsmenge an Ziel-DNA gering war, es kann aber auch auf eine niedrige Effizienz der PCR-Reaktion hinweisen. Darüber hinaus kann die Möglichkeit einer Kontamination die Ergebnisse beeinflussen, so dass sie fälschlicherweise als positiv erscheinen.

Aus diesem Grund ist es wichtig, strenge Qualitätskontrollen durchzuführen und die Möglichkeit von Alternativerklärungen zu berücksichtigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die quantitative RT PCReine wirksame Methode zur Detektion und Quantifizierung spezifischer DNA-Sequenzen ist. Sie erfordert jedoch Sorgfalt bei der Durchführung und Interpretation der Ergebnisse. Mit der richtigen Ausführung und Vorsicht kann die RT PCR zuverlässige und genaue Ergebnisse liefern.