Molekulare Diagnostik

Molekulare Diagnostik ist ein Teilgebiet der medizinischen Diagnostik, das genetische, proteomische und metabolische Veränderungen nachweist, die für Krankheiten relevant sind. Sie wird in Bereichen wie der Onkologie, Genetik und Infektiologie eingesetzt.

Die Molekulare Diagnostik ist wie die Suche nach einer bestimmten Person in einem riesigen Raum voller Menschen, mit nur einer winzigen Information wie der Farbe der Schuhe. Sie sucht nach den kleinsten Hinweisen in Zellen und Genen, um Krankheiten zu identifizieren und zu charakterisieren.

Die Molekulare Diagnostik ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Krankheiten, die Definition von genetischen Risiken und die Auswahl personalisierter Therapien basierend auf dem genetischen und molekularen Profil jedes Patienten.

In der Ausbildung zur MFA lernst du die Grundlagen der Genetik und Molekularbiologie, verschiedene Methoden der Molekularen Diagnostik, den Informationsaustausch über Testergebnisse und deren Bedeutung, sowie wann diese Tests verwendet werden und welche Rolle sie in der Patientenversorgung spielen.

Ein Biomarker ist eine Substanz, die in erhöhten Mengen im Körper gefunden wird, wenn eine Krankheit vorhanden ist. Bei Krebserkrankungen kann ein Biomarker auf das Vorhandensein der Krankheit hinweisen und zur Überwachung des Krankheitsverlaufs dienen.

Der EGFR-Mutationsstatus gibt Aufschluss über das genetische Profil des Krebses. Bei Vorhandensein einer EGFR-Mutation können spezifische zielgerichtete Therapien angewandt werden, die sich als effektiver erweisen können als eine Standardchemotherapie.

Die molekulare Diagnostik kann spezifische Moleküle erkennen, die eine allergische Reaktion auslösen. Sie ermöglicht eine genauere Bewertung der allergischen Sensibilisierung eines Patienten, indem sie die spezifischen Moleküle identifiziert, die die allergische Reaktion verursachen.

Bei der birkenpollenbezogenen Fruchtallergie kann die molekulare Diagnostik das Protein Bet v 1 identifizieren, das in Birkenpollen und bestimmten Früchten vorkommt und die allergische Reaktion auslöst. So kann ein Patient gezielt auf den Verzehr dieser Früchte verzichten.

Die drei wichtigen Geräte in einem Labor für Molekulare Diagnostik sind PCR-Geräte, Genomsequenzer und Mikroarray-Scanner.

Typische Aufgaben beinhalten die Isolierung von DNA oder RNA aus Patientenproben, Durchführung von PCR, Vorbereitung von Proben für Sequenzierungs- oder Mikroarray-Experimente, Datenanalyse, Berichterstellung und Präsentation der Ergebnisse.

Ein PCR-Gerät wird zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) genutzt, welche spezifische Segmente der DNA kopiert und vervielfältigt.

Genomsequenzer werden zur Sequenzierung von Genomen verwendet und bestimmen die exakte Reihenfolge der Bausteine in einem DNA-Molekül.

Das PCR-Verfahren (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine labortechnische Methode, die DNA oder RNA vervielfältigt. Es wird in vielen Bereichen, im Besonderen aber in der Biotechnologie, Medizin und Molekularbiologie eingesetzt, zum Beispiel zur Diagnose von Infektionskrankheiten und für genetische Untersuchungen.

Im PCR-Verfahren werden DNA-Segmente zuerst durch Erhitzung getrennt. Dann binden kurze DNA-Stücke, sogenannte Primer, an die Einzelstränge. Danach baut ein Enzym namens DNA-Polymerase neue DNA-Stränge entlang der vorhandenen auf. Dieser Prozess wird mehrfach wiederholt, um das gewünschte DNA-Segment exponentiell zu vervielfältigen.

Das PCR-Verfahren ist durch drei Hauptmerkmale charakterisiert: Genauigkeit (es kann auf spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen abzielen), Schnelligkeit (es kann Milliarden von Kopien einer DNA- oder RNA-Sequenz in wenigen Stunden erzeugen) und Flexibilität (es kann auf beliebige DNA- oder RNA-Quellen angewendet werden).

Es gibt viele verschiedene Arten von PCR-Verfahren, darunter die quantitative PCR zur Messung der Menge an DNA oder RNA, die Reverse Transkription PCR zur Umschreibung von RNA in DNA, und die Multiplex-PCR zur gleichzeitigen Vervielfältigung mehrerer DNA-Segmente.

Zu den Hauptaufgaben einer MFA im Kontext des PCR-Tests gehören die Probenentnahme, die Bereitstellung der Proben für das Labor, die Kommunikation mit dem Patienten und Erläuterung des Testverfahrens sowie die Dokumentation und Nachverfolgung der Proben und Testergebnisse.

Die Probenentnahme für einen PCR-Test erfolgt in der Regel mittels eines speziellen Tupfers, der tief in Nase oder Rachen eingeführt wird. Dabei muss ausreichend Material gesammelt werden, um eine genaue Analyse mittels PCR zu ermöglichen.

Die grundlegenden Schritte eines PCR-Tests sind die Extraktion des genetischen Materials aus der Probe, die Denaturierung der DNA, das Annealing, die Extension, die Amplifikation und abschließend die Detektion des gesuchten Erregers.

In der Praxis dauert die Analyse eines PCR-Tests im Labor meist mehrere Stunden. Hinzu kommt die Zeit für die Probenentnahme und den Transport ins Labor. Insgesamt kann das Ergebnis eines PCR-Tests daher in der Regel innerhalb von 24 bis 48 Stunden vorliegen.

Die erste Phase der PCR ist die Denaturierung. In dieser Phase wird die DNA-Probe auf etwa 95 °C erhitzt, wodurch die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen der DNA-Doppelhelix brechen und einzelsträngige DNA gebildet wird.

Während der Annealing-Phase werden die Temperatur gesenkt und kurze DNA-Abschnitte, die als Primer bezeichnet werden, an die einzelsträngige DNA angebunden. Die Primer sind spezifisch für den Abschnitt der DNA, der vervielfältigt werden soll.

Der Hauptzweck der PCR ist es, spezifische DNA-Sequenzen zu vervielfältigen. Durch die Wiederholung der drei Phasen - Denaturierung, Annealing und Extension - können Forscher Millionen von Kopien bestimmter DNA-Sequenzen erstellen.

Die PCR hat vielfältige Anwendungen, darunter die Früherkennung von Infektionskrankheiten, genetische Forschung, forensische Wissenschaft (z.B. zum Erstellen von DNA-Profilen) und Paläontologie (z.B. zur Analyse alter DNA-Proben).

Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction), auch quantitative PCR (qPCR) genannt, ist eine Technik zur Amplifikation und gleichzeitigem Quantifizieren von spezifischen DNA-Sequenzen in Echtzeit.

Bei der Real-Time PCR wird die DNA-Amplifikation in Echtzeit beobachtet, während bei der herkömmlichen PCR das Ergebnis erst nach Abschluss des Zyklus sichtbar ist. Der Unterschied liegt im Einsatz fluoreszierender Sonden bei der Real-Time PCR.

Ein qualitativer Test gibt Auskunft darüber, ob eine bestimmte DNA-Sequenz vorhanden ist oder nicht. Ein quantitativer Test ermittelt die genaue Menge der DNA-Sequenz in der Probe.

Die Real-Time PCR unterscheidet sich von der herkömmlichen PCR durch einen zusätzlichen Schritt: die Detektion des Amplifikationsprodukts in Echtzeit mittels fluoreszierenden Sonden, die ein messbares Signal abgeben.

Die notwendigen Komponenten für die Real-Time PCR sind die zu analysierende DNA-Probe, die flankierenden Primer, die DNA-Polymerase, die dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) und fluoreszierende Sonden.

Der zentrale Vorteil der Real-Time PCR gegenüber anderen PCR-Techniken ist die Fähigkeit, quantitative Daten über die ursprüngliche DNA zu liefern. Sie erlaubt nicht nur zu sehen, ob eine Sequenz vorhanden ist, sondern auch, wie viel davon in der ursprünglichen Probe enthalten war.

Die Amplifikationskurve ist ein graphisches Werkzeug in der Real-Time PCR, das die Menge an produzierten DNA-Strängen in jedem Zyklus darstellt. Jeder Punkt auf der Kurve repräsentiert das Fluoreszenzsignal zu einem bestimmten Zeitpunkt während der PCR-Zyklen.

Der Ct-Wert (Cycle Threshold) ist der Zyklus in der Real-Time PCR, in dem das Fluoreszenzsignal die Hintergrundfluoreszenz deutlich übersteigt. Er korreliert mit der Anfangsmenge der Ziel-DNA und spielt eine wichtige Rolle bei der Quantifizierung und Interpretation von Real-Time PCR-Daten.

Qualitative Daten in der Real-Time PCR geben Auskunft darüber, ob die DNA-Sequenz in der Probe vorhanden ist oder nicht. Quantitative Daten hingegen geben Auskunft über die genaue Menge der Ziel-DNA in der Probe.

Real-Time PCR ist ein wichtiges Werkzeug in der diagnostischen Molekularbiologie und Genetik. In der MFA-Ausbildung wird sie für die Pathogen-Diagnostik, Genexpressionsanalyse und DNA-Methylierungsanalyse verwendet. Das Verständnis dieser molekularen Techniken erhöht die Karrierechancen der Studierenden auf dem Arbeitsmarkt.

Die Real-Time PCR wird in der medizinischen Diagnostik verwendet, um Pathogene zu bestimmen und Antibiotikaresistenzen zu identifizieren. Sie kann auch zur Genexpressionsanalyse und zur DNA-Methylierungsanalyse eingesetzt werden.

Der Hauptvorteil der Real-Time PCR gegenüber der traditionellen PCR besteht darin, dass sowohl die Amplifikation von DNA-Sequenzen in Echtzeit überwacht als auch wertvolle quantitative Informationen gesammelt werden können. Dies ermöglicht eine genauere und effektivere Analyse.

Die Hauptfunktion der Reverse Transkriptase in der RT PCR ist es, aus einer RNA-Matrize eine komplementäre DNA (cDNA) zu synthetisieren. Dieser Prozess wird auch als Reverse Transkription bezeichnet.

Die Hauptfunktion der DNA-Polymerase in der RT PCR ist es, die cDNA zu amplifizieren. Sie repliziert die DNA-Stränge und erzeugt so millionenfache Kopien der Ziel-DNA.

Die RT PCR wird vor allem in der diagnostischen Medizin und genetischen Forschung eingesetzt. Beispiele dafür sind die Diagnostik von Infektionskrankheiten wie Covid-19 und die Molekulare Forensische Analyse (MFA).

Die MFA (Molecular Forensic Analysis) ist ein Bereich der forensischen Wissenschaft, der molekulare Techniken wie die RT PCR nutzt, um genetische Informationen aus forensischen Proben zu extrahieren und zu interpretieren.

Das Reagenzgemisch der RT PCR beinhaltet Wasser, dNTPs (Nukleotide), MgCl2 (Magnesiumchlorid), RNAse Inhibitor, Reverse Transkriptase, Taq-Polymerase, Primer und die RNA Probe.

Die Temperaturzyklen in einer RT PCR bestehen aus Initiale Denaturierung, Denaturierung, Annealing, Verlängerung (Elongation) und Endverlängerung.

Die RT PCR startet mit RNA statt DNA und erfordert daher eine Reverse Transkription. Sie ist auch quantitativ und nicht nur qualitativ. Außerdem muss die Temperatur und die Länge der Verlängerung spezifisch für jedes Experiment optimiert werden.

RT PCR ist für Kontaminationen anfällig, weil selbst eine kleine Menge DNA die Ergebnisse stark beeinflussen kann. Daher sind Sauberkeit und Sorgfalt bei der Vorbereitung und Durchführung von RT PCR entscheidend.

Die Ct-Werte (Cycle Threshold) geben die Anzahl der Zyklen an, welche benötigt werden, um eine festgelegte Fluoreszenzschwelle zu überschreiten. Ein niedriger Ct-Wert deutet auf eine hohe Ausgangsmenge des Zielmoleküls hin.

Eine positive Probe zeigt eine klare Amplifikationskurve, die die Fluoreszenzschwelle überschreitet. Bei einer negativen Probe gibt es keine Amplifikationskurve und keine Überschreitung der Schwelle.

Kontrollen dienen dazu, die korrekte Funktion der RT-PCR sicherzustellen. Eine positive Kontrolle sollte immer die Fluoreszenzschwelle erreichen und eine negative Kontrolle sollte nie eine Amplifikationskurve zeigen.

Ja, die RT-PCR ist eine quantitative Methode. Sie ermöglicht es, die Menge der Ziel-DNA zu bestimmen, da je höher die DNA-Menge, desto schneller ein signifikantes Fluoreszenzsignal erzeugt wird.

Die Multiplex PCR ist eine Variante der PCR, in welcher mehrere genetische Sequenzen in einer einzigen PCR-Reaktion gleichzeitig amplifiziert werden. Sie dient der effizienten Nutzung von Ressourcen und verkürzt die Gesamtzeit des PCR-Prozesses.

Bei der Multiplex PCR werden mehrere Primerpaare gleichzeitig zur DNA-Probe hinzugefügt. Diese Primer sind spezifisch für die Ziel-DNA-Sequenzen, die amplifiziert werden sollen. Dann folgen die Schritte Denaturierung, Annealing und Extension wie bei der herkömmlichen PCR.