In einem Versuch in der Schule hast Du eine Lösung mit unbekannten Aminosäuren vor Dir. Deine Aufgabe ist es nun zu bestimmen, welche Aminosäuren sich darin befinden.
Um diese Aufgabe zu lösen, kannst Du Dir das Prinzip der isoelektrischen Fokussierung zunutze machen. Hierbei trennen sich die Aminosäuren Deiner Lösung anhand ihrer isoelektrischen Punkte auf und Du kannst sie durch diesen charakteristischen Wert identifizieren.
Isoelektrischer Punkt Definition
Der isoelektrische Punkt (kurz: IEP, pI, pHi) beschreibt den pH-Wert einer wässrigen Lösung, bei dem ein Zwitterion oder ein Ampholyt nach außen hin neutral, also isoelektrisch ist.
Als Zwitterion wird eine Verbindung bezeichnet, die zwei oder mehrere funktionelle Gruppen besitzt. Dabei ist die Ladung einer funktionellen Gruppe positiv und die Ladung der anderen negativ. Beispiele dafür sind Aminosäuren und Proteine.
Ein Ampholyt ist eine Verbindung, die sowohl als Base, als auch als Säure agieren kann. Beispiele dafür sind Wasser oder Ammoniak.
Nicht nur Aminosäuren und Proteine können durch den isoelektrischen Punkt beschrieben werden, sondern alle Moleküle, die einen zwitterionischen Aufbau zeigen.
Der isoelektrische Punkt ist für jedes Molekül individuell und trägt somit zur Charakterisierung der Verbindung bei.
Isoelektrischer Punkt Elektrophorese
Um den isoelektrischen Punkt eines Proteins oder einer Aminosäure zu bestimmen, ist es möglich, eine Elektrophorese durchzuführen.
Die Elektrophorese beschreibt eine analytische Trennmethode, bei der geladene Teilchen auf einem Trägermedium im elektrischen Feld wandern. Die zurückgelegte Strecke gibt Aufschluss über die Ladung, das Gewicht und die Größe des Moleküls.
Bei der Bestimmung des isoelektrischen Punkt, was auch isoelektrische Fokussierung genannt wird, findet häufig die Papierelektrophorese Verwendung.
Auf einem Streifen Filterpapier wird ein Startpunkt markiert und mit einer Pufferlösung angefeuchtet, dessen pH-Wert bekannt ist. Auf den Startpunkt wird eine Aminosäurelösung aufgetragen. Dann wird das Papier durch zwei Kontakte an das elektrische Feld angeschlossen. Nach einiger Zeit werden die Kontakte entfernt, der Streifen getrocknet und anschließend mit einer Ninhydrinlösung besprüht, die die Aminosäure sichtbar macht. Nun kann man erkennen, in welche Richtung und wie weit die Aminosäure gewandert ist. Wenn die Aminosäure in Richtung der Kathode (Minuspol) gewandert ist, überwiegt die positive Ladung. Wenn eine Wanderung in Richtung der Anode (Pluspol) stattgefunden hat, überwiegt die negative Ladung.
Allgemein lässt sich sagen, dass die Aminosäuren erst dann stehen bleiben, wenn sie die Elektroneutralität und somit den isoelektrischen Punkt erreicht haben.
Isoelektrischer Punkt berechnen
Durch die Elektrophorese kannst Du den isoelektrischen Punkt einer Aminosäure oder eines Proteins grob bestimmen, genau wird der Wert erst bei der Berechnung. Zunächst werden die pKs-Werte der funktionellen Gruppen benötigt.
Der pKs-Wert ist eine Stoffkonstante, die die Stärke einer Säure beschreibt. Hierbei gilt, je kleiner der pKs-Wert, desto stärker die Säure.
Mehr zum pKs-Wert findest Du in der gleichnamigen Erklärung.
Anhand eines Beispiels mit der Aminosäure Glycin wird die Berechnung des isoelektrischen Punkts noch etwas deutlicher.
Die Formel zur Berechnung des pH-Wertes, an dem das Molekül den isoelektrischen Punkt erreicht, lautet:
Die pKs-Werte für Glycin sind pKs1 = 2,4 und pKs2 = 9,8. Wenn Du diese Werte in die Gleichung einsetzt, erhältst Du folgendes Ergebnis:
Somit ergibt sich für die Aminosäure Glycin ein pH-Wert von 6,1 für den isoelektrischen Punkt.
Bei einigen Aminosäuren kann es der Fall sein, dass sie mehr als zwei pKs-Werte besitzen. Wenn eine basische Aminosäure vorliegt, rechnest Du mit den pKs-Werten der Aminogruppe. Bei einer sauren Aminosäure nimmst Du die beiden pKs-Werte der Säuregruppe.
Isoelektrischer Punkt Aminosäuren
Aminosäuren sind organische Verbindungen, die mindestens eine Aminogruppe und mindestens eine Carboxylgruppe (Säuregruppe) besitzen, somit handelt es sich um Zwitterionen.
Die Carboxylgruppe ist negativ geladen und gibt Protonen ab, wohingegen die Aminogruppe positiv geladen ist und Protonen aufnimmt.
Am isoelektrischen Punkt gleichen sich die negative und positive Ladung der beiden funktionellen Gruppen aus und das Molekül ist nach außen hin neutral.
Wenn der pH-Wert unter dem isoelektrischen Punkt liegt, dissoziiert die Säuregruppe weniger stark, was eine positive Gesamtladung zur Folge hat. Bei einem pH-Wert höher als der isoelektrische Punkt nimmt die Dissoziation zu und die Gesamtladung des Moleküls wird negativ.
Isoelektrischer Punkt Lysin
Die Aminosäure Lysin stellt einen Sonderfall der Aminosäuren dar. Sie besitzt drei funktionelle Gruppen, zwei Aminogruppen und eine Carboxylgruppe. Somit ergeben sich daraus auch drei pKs-Werte. Da es sich bei Lysin um eine basische Aminosäure handelt, setzt Du die beiden pKs-Werte der Aminogruppen ein.
Daraus ergibt sich dann ein isoelektrischer Punkt von 9,74.
Abb. 1: Aminosäure Lysin
Isoelektrischer Punkt Proteine
Auch bei Proteinen handelt es sich um Ampholyten, die sowohl negative Ladungen durch beispielsweise Carboxylgruppen als auch positive Ladungen durch etwa die basischen Aminosäuren Arginin und Lysin.
Proteine sind Makromoleküle, die aus vielen einzelnen Aminosäuren aufgebaut sind.
Die eingebauten Aminosäuren der Proteine haben eine Vielzahl an unterschiedlichen Ladungen und pKs-Werten.
Somit hängt die Nettoladung des Proteins stark vom umgebenden pH-Wert ab. Am isoelektrischen Punkt besitzt das Protein somit keine Ladung mehr und es ist nach außen hin neutral. An diesem Punkt ist das Protein zudem unlöslich.
Das Prinzip der isoelektrischen Fokussierung wird häufig zum Fällen der Proteine genutzt. Das bedeutet, dass Proteine unlöslich gemacht und so aus der Lösung extrahiert werden können. Da das Protein am isoelektrischen Punkt sein Minimum an Löslichkeit erreicht hat, findet eine Ausfällung aus der Lösung statt und das Makromolekül kann extrahiert werden.
Isoelektrischer Punkt – Das Wichtigste
Isoelektrischer Punkt Definition: Der isoelektrische Punkt beschreibt den pH-Wert eines zwitterionischen Moleküls, bei dem die Ladung nach außen hin neutral, also isoelektrisch ist.
Den isoelektrischen Punkt kann man mithilfe der Elektrophorese bestimmen.
Um den isoelektrischen Punkt genau zu berechnen, benötigt man die pKs-Werte der funktionellen Gruppen. Diese werden addiert und durch zwei geteilt.
Isoelektrischer Punkt Aminosäuren: Bei Aminosäuren handelt es sich um Zwitterionen, die wegen ihrer Aminogruppe eine positive Ladung und aufgrund der Carboxylgruppe eine negative Ladung tragen.
Proteine sind Ampholyten, die ebenfalls positiv und negativ geladen sind, das hat zur Folge, dass sie sowohl als Base, als auch als Säure agieren können.
Nachweise
- Spektrum.de. Isoelektrischer Punkt. (28.10.22)
- Jeremy M. Berg et al. (2018). Stryer Biochemie. Springer.
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