Biuret-Reaktion

Grundlagen der Biuret-Reaktion

Die Biuret-Reaktion ist eine quantitative chemische Nachweisreaktion. Das heißt, sie zeigt, wie groß die Menge des Stoffs ist, die in der Probe vorhanden ist (quantitativ von lateinisch quantitas für "Menge"). Die Menge ist bei chemischen Analysen auf die Stoffmengenkonzentration bezogen.

Die Nachweisreaktion wird auch als Biruet-Assay oder als Biuret-Test bezeichnet. Die Biuret-Reaktion gilt als Nachweisreaktion für das Moleküls Biuret und Proteine (=Eiweiße) in wässriger Lösung.

Das Biuretmolekül

Biuret ist eine organische Verbindung mit der Summenformel C₂H₅N₃O₂. Es handelt sich um ein Carbonsäureamid, das auch als Carbamoylharnstoff bezeichnet wird. Der Feststoff ist farblos, kristallin und wasserziehend (hygroskopisch).

Abbildung 1: Strukturformel von Biuret

Aufgrund des Amids innerhalb des Moleküls bildet sich in Gegenwart von Kupferionen ein blau-violetter Komplex.

Biuret-Reagenz herstellen

Erhitzt man Harnstoff ($\ne$Harnsäure) über den Schmelzpunkt von etwa 133° Celsius, so entsteht ein Biuretmolekül unter Abspaltung eines Ammoniakmoleküls. Durch die Entstehung des Ammoniaks bildet sich ein stechender Geruch.

Abbildung 2: Reaktionsgleichung zur Herstellung von Biuret

Wie du an der Reaktionsgleichung siehst, reagieren zwei Harstoffmoleküle zu einem Biuretmolekül (und einem Ammoniakmolekül).

Nachweisprinzip der Biuret-Reaktion

Anders als der Namen vermuten lässt, benötigt man für die Biuret-Reaktion kein Biuret. Die Reaktion heißt so, weil sie für Biuret ein "positives" Ergebnis liefert. Nun sind die Aminosäuren von Peptiden und Proteinen über sogenannte Peptidbindungen verknüpft. Dabei handelt es sich um Sonderfälle der Amidbindung.

Demnach dient die Biuret-Reaktion eigentlich zum Nachweis von Amiden. Damit sich ein Komplex ausbilden kann, muss die zu untersuchende Substanz mindestens zwei Peptidbindungen enthalten. Als Biuret-Reagenz wird Kupfersulfat (CuSO₄) verwendet. Dabei muss ein alkalisches Milieu vorherrschen.

Enthält die zu testende Lösung weder Peptide/Proteine noch Biuret, so fällt schwerlösliches Kupferhydroxid aus. Sind jedoch Peptid- bzw. Amidbindungen vorhanden, so bilden diese mit den Kupferionen (Cu²⁺) der Kupfersulfatlösung einen Komplex, wodurch sich die Lösung blau-violett (teilweise auch rötlich) färbt.

Abbildung 3: Der bei der Biuret-Reaktion entstandene Komplex, der für die violette Färbung der Lösung verantwortlich ist

Prüft man eine Substanz wie bspw. Eiklar auf Peptidbindungen, so kann man den Versuch auch zusätzlich mit Biuret durchführen. Dadurch erhält man eine Kontrolllösung mit definierter Konzentration anhand derer die Farbintensität verglichen werden kann.

Abbildung 4: Biuret-Reaktion auf zwei Probelösungen angewandt

Da die Bildung der farbigen Komplexe proportional zu der Ausgangskonzentration an Proteinen ist, kann mithilfe eines Photometers die Farbintensität gemessen werden. Mithilfe der Farbintensität kann man die Konzentration der Peptidbindungen berechnen. Daher ist die Biuret-Reaktion eine quantitative Nachweismethode.

Spezifität der Biuret-Reaktion

Die Empfindlichkeit der Reaktion ist gering, sodass für die Bestimmung ca. 1 – 10 mg Protein benötigt werden, damit sich eine Farbveränderung zeigt. Dafür besitzt die Biuret-Reaktion eine hohe Spezifität. Neben Proteinen bilden sich nur bei Peptiden auch farbige Komplexe.