KM3 - Methoden der Molekularen Medizin at Universität Marburg

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Warum wird HindIII nach der Restriktion hitzeinaktiviert?

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Dichtegradienten-Zentrifugation

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Sedimentationskoeffizient

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Was ist in LB enthalten und warum?

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Einfluss pH-Wert auf Km und Vmax

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isotonische Kochsalzlösung

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chromogenes Substrat

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Enzyme

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Entwicklung eines einfachen optisch-enzymatischen Tests zur Bestimmung der Aktivität der Malat-Dehydrogenase des Citratzyklus:

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Spektroskopie

Photometrie 

Kolometrie

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Inhibitortypen bei saurer Phosphatase von:

-Phosphat

-Fluorid

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KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Warum wird HindIII nach der Restriktion hitzeinaktiviert?

 Hind III wird hitzeinaktiviert, damit es den erfolgreich ligierten Vektor-Insert-Komplex nicht wieder zerschneidet. Zudem sollen so Star-Aktivitäten des Hind III im weiteren Verlauf des Versuchs verhindert werden.


KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Dichtegradienten-Zentrifugation

Sedimentationsrate v ist null wenn die Dichte des Mediums der Dichte des Partikels entspricht 

Medium (Zucker da Reagenz was sehr gut in Wasser löslich ist (zunehmende Konzentration des Zuckers -> zunehmende Dichte / Nycodenz/Ficoli) mit nach unten zunehmender Dichte -> Zellorganellen bleiben in Bereich ihrer Dichte ->  Bandierung der verschiedenen Zellorganellen 


Stufengradient (s.o.), kontinuierlicher Gradient (meist gebräuchlicher) Erstellung durch Gradientenmischer 

hier Verwendung Swing-Out Rotoren

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Sedimentationskoeffizient

während des Lauf erreichen Partikel eine konstante Sinkgeschwindigkeit (Zentrifugalkraft = Reibung (Kräfte im Gleichgewicht -> konstante Sinkgeschwindigkeit) 

Sedimentationsrate gibt an wie schnell ein Teilchen sinkt

Sedimentationskoeffizient eines Teilchens ist in definiertem Medium konstant -> er ist eine Materialkonstante (Einheit: Svedberg S 10^-13 s) (Beispiel Svedberg bei 40 S/ 70 S Ribosomen (unterschiedliche Größe)) 

Sedimentationsrate v ist proportional zu Größe und Dichte eines Teilchens (je größer, dichter desto schneller ist es am Boden -> differenzielle Zentrifugation


-> 600* g steht für 600 * Erdbeschleunigung (relative Znetrifugalkraft (Rotorausstattung, Lageunabhängig)) 

Auftrennung nach Sedimentationskoeffizienten bei differenzieller Zentrifugation (erstes Sediment Zellkern) 

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Was ist in LB enthalten und warum?

3.) In Luria Broth sind alle notwendigen Nährstoffe für die Bakterien enthalten. Trypton ist eine Mischung von Proteinen und dient somit als Aminosäurequelle. Hefeextrakt dient als Quelle für Kohlenhydrate, Spurenelemente und Enzyme. Natriumchlorid liefert die notwendigen Ionen bzw. das isotonische Milieu. Aqua bidest dient als Lösungsmittel.

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Einfluss pH-Wert auf Km und Vmax

Bei einem verringerten pH-Wert von 4,6 (im Verleich zu 5,4) sinkt sowohl die Maximalgeschwindigkeit vmax der Reaktion als auch der KM-Wert, was einem Anstieg der Affinität entspricht. Bei einem höheren pH-Wert von 6,2 (im Verleich zu 5,4) steigt die Maximalgeschwindigkeit vmax der Reaktion hingegen, ebenso wie der KM-Wert, was einer verringerten Affinität entspricht. Bei den verwendeten Substratkonzentrationen erreicht die saure Phophatase in den meisten Fällen die beste Umsatzgeschwindigkeit beim pH 5,4, da hier das Zusammenspiel aus höherer vmax im Vergleich zum pH 4,6 und niedrigerem KM (also höherer Substrataffinität) im Vergleich zum pH 6,2 optimal ist.

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

isotonische Kochsalzlösung

eine zum Blutplasma isoosmotische(/isotonische) Lösung aus Natriumchlorid in Wasser. Isoosmotisch bedeutet, dass zwei Lösungen dieselbe Anzahl an gelösten Teilchen enthalten. Die Lösung enthält 9 g Kochsalz pro Liter.

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

chromogenes Substrat

Farbstoff bildendes Substrat

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Enzyme

= Proteine, Biokatalysatoren

Enzyme, die aus Nucleinsäuren bestehen = Ribozyme (z.B: Ribosomen)

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Entwicklung eines einfachen optisch-enzymatischen Tests zur Bestimmung der Aktivität der Malat-Dehydrogenase des Citratzyklus:

Bei der Entwicklung eines einfachen optisch-enzymatischen Tests muss entweder ein Substrat, Produkt oder Coenzym direkt photometrisch nachweisbar sein (wie z.B. NADH). Die Malatdehydrogenase des Citratzyklus benötigt NAD+ als Coenzym bei der Oxidation von Malat zu Oxalacetat. Das Gleichgewicht der Reaktion liegt auf Seiten der Malatbildung, also sollte die Reaktion wie im Versuch 2 als Reduktion des Oxalacetats mit Oxidation des NADH betrachtet werden: 

Oxalacetat + NADH <-> Malat + NAD+ 

Die zur Malatbildung proportionale Oxidation des NADH wird photometrisch bei 340 nm verfolgt

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Spektroskopie

Photometrie 

Kolometrie

Spektroskopie bezeichnet eine Gruppe physikalischer Methoden, die eine Strahlung nach einer bestimmten Eigenschaft wie Wellenlänge, Energie, Masse etc. zerlegen. Die dabei auftretende Intensitätsverteilung wird Spektrum genannt. Spektrometrie ist die quantitative Ausmessung von Spektren mittels eines Spektrometers. 


Als Photometrie bezeichnet man Messverfahren im Wellenlängenbereich des ultravioletten und sichtbaren Lichts. 


Als Kolorimetrie wird die quantitative Bestimmung von Substanzen auf Grund ihrer Farbe bezeichnet. Eine chemische Verbindung ist immer dann farbig, wenn sie Strahlung im Spektralbereich des sichtbaren Lichts (400 bis 800 nm) absorbiert

KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

Inhibitortypen bei saurer Phosphatase von:

-Phosphat

-Fluorid

Mit steigender Phosphatkonzentration steigt der KM-Wert (die Affinität sinkt) während vmax konstant bleibt. Dies ist kennzeichnend für eine kompetitive Hemmung, bei dieser bindet der Inhibitor an das aktive Zentrum des Enzyms und besetzt so die Bindungsstelle des Subtrats. Es kann somit kein Substrat gebunden werden, dadurch sinkt (scheinbar) die Affinität zum Substrat. Bei hohen Substratkonzentrationen bindet hingegen weiterhin hauptsächlich Substrat an das aktive Zentrum und wird unverändert umgesetzt (da die im Vergleich geringere Menge an Inhibitor weniger stark ins Gewicht fällt), so dass vmax weiterhin erreicht wird. 

->Wie am konstanten vmax und steigendem KM erkennbar ist, handelt es sich um eine kompetitive Hemmung. Phopshat bindet hierbei an das aktive Zentrum der sauren Phosphatase und verhindert so, dass das eigentliche Substrat (das 4-Nitrophenylphosphat) binden kann und umgesetzt wird. Dies lässt sich auch am Namen und Reaktionsmechanismus der sauren Phosphatase nachvollziehen: Es handelt sich um ein Enzym, das Phosphatgruppen abspaltet und somit auf die Bindung eines Phosphat(-Restes) ausgelegt ist, so dass freies Phosphat passgenau an das aktive Zentrum binden kann. 


Mit steigender Fluoridkonzentration sinken sowohl vmax als auch der KM-Wert (die Affinität steigt). Dies ist kennzeichnend für eine unkompetitive Hemmung. Bei dieser bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat[ES]-Komplex und verhindert damit die Umsetzung des Substrats und dessen Dissoziation. Da die Affinität angibt, wie schnell sich der [ES]-Komplex bildet und wieder zerfällt, steigt in diesem Fall (scheinbar) die Affinität, da sich das Substrat nicht mehr vom Enzym lösen kann. Die Maximalgeschwindigkeit vmax sinkt, da ein Teil der Enzyme im [ES]-Komplex gebunden bleibt und somit der Reaktion weniger freies Enzym zur Verfügung steht. 

->Bei der Hemmung mit Fluorid, sinken sowohl vmax als auch KM , es handelt sich daher um eine unkompetitive Hemmung. Fluorid bindet an den [ES]-Komplex aus saurer Phosphatase und 4-Nitrophenylphosphat und verhindert die Umsetzung. Im Gegensatz zur kompetitiven Hemmung ist dieser Hemmtyp oft irreversibel, so dass (freies) Enzym aus dem System dauerhaft entfernt wird und nicht mehr zur Verfügung steht. Im biologischen System ist bei solch einer Hemmung eine Neusynthese des Enzyms nötig, damit es wieder zur Verfügung steht. 



KM3 - Methoden der Molekularen Medizin

petite Mutanten

petite (ρ–) is a mutant first discovered in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Due to the defect in the respiratory chain, 'petite' yeast are unable to grow on media containing only non-fermentable carbon sources (such as glycerol or ethanol) and form small colonies when grown in the presence of fermentable carbon sources (such as glucose). The petite phenotype can be caused by the absence of, or mutations in, mitochondrial DNA (termed "cytoplasmic Petites"), or by mutations in nuclear-encoded genes involved in oxidative phosphorylation.A neutral petite produces all wild type progeny when crossed with wild type. 


Hefe-Stämme, in denen durch Mutation der entsprechenden Gene einige oder sämtliche der in den Mitochondrien lokalisierten Enzyme der Atmungskette fehlen oder defekt sind, wodurch die Atmungskette ausfällt. Die betreffenden Zellen können Energie nur noch durch den weniger effizienten anaeroben Abbau von Nährstoffen (Gärung) gewinnen. Bei gleicher Zellengröße wird dadurch die Teilungsrate herabgesetzt, und die Kolonien der Petite-Mutanten sind klein (franz. "petit") im Vergleich zu den Kolonien des Wildtyps. Der Petite-Phänotyp kann durch Mutationen im Kern (werden nach den Mendelschen Regeln vererbt) oder durch eine mehr oder weniger ausgedehnte Deletion mitochondrialer DNA-Abschnitte (führt zu einer nicht-mendelnden Vererbung des Merkmals) zustandekommen.

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