Protein-Engineering at TU München

• Insulin aus Schweinepankreas (Diabetes mellitus Typ 1)
• Wachstumshormon (Somatotropin) aus menschlicher Hypophyse (Zwergwuchs)
• Antitoxine aus Pferdeserum (Diphterie, Tetanus)

• Insulin Humulin aus E.coli (Diabetes mellitus Typ 1)
• Protropin rhGH Wachstumsfaktor aus E.Coli (Zwergwuchs)
• Erythropoetin aus Zellkultur (Niereninsuffizienz)

Kontrolle des Blutzuckerspiegels ≤ 100 mg Glucose / 100 ml

β-Zellen der Langerhans´schen Inseln in der Bauchspeicheldrüse (Glucose-abhängige Genexpression)

2 Polypeptidketten, 3 Disulfidbindungen

• Insulin Lispro (Permutation ProB28 – LysB29) beschleunigte Wirkung (nach 15 min, Abfall nach 2-4 h, Maximum bei 1 h)
• Insulin Glargine (Austausch des C-terminalen Asp durch Gly)
  Insulin Glargine: verzögerte Wirkung (extrem verlangsamte Auflösung des Insulins)

Stabilisierung des Insulinmonomers bei Insulin Lispro bzw. Stabilisierung der Kristallpackung und Hexamerbildung bei Insulin Glargine

Templatesequenzen: human und murin

Nachteil: Verwendung von Konsensussequenzen des AK à kommen im Menschen so nicht vor

heute: Sequenz eines tatsächlich genetisch codierenden AKs (mit hoher Verwandtschaft)

Indikationsgebiet: 

Metastasierender Brustkrebs in Kombination mit Chemotherapie

Wirkprinzip: 

Störung der aktiven Dimerisierung durch unphysiologische Komplexbildung des therapeutischen AKs mit dem Rezeptor; Clustering der Plasmamembran führt zur beschleunigten Internalisierung von HER2 durch Endocytose (Verringerung der Konzentration an der Zellmembran, damit erniedrigte Signaltransduktion); Inhibition der HER2-Proteolyse (Shedding der extrazellulären Domäne)

Cytosolische Produktion in E.coli:

• Ersatz des Signalpeptids durch n-terminalen Met-Rest (-> Immunogenität)
• Extraktion aus Einschlusskörpern und oxidative Rückfaltung 

à Protropin/Methionyl-hGH/Met-Somatotropin von Genentech

Cytosolische Produktion von Met-Ala-Glu-GH

• Met wird von der Methionin-Aminopeptidase in vivo abgespalten
• Nach Isolierung des rekombinanten Proteins wird das Ala-Glu-Dipeptid enzymatisch prozessiert

àGenotonorm bzw. Genotropin von Pharmacia&Upjohn

Biosynthese

• Biosynthese des Präproteins in E.coli führt zur Sekretion in das bakterielle Periplasma
• das prozessierte und gefaltete Protein wird nach osmotischem Schock in aktiver Form isoliert. Humatrope von Elli Lilly

• Gezielte Veränderung anhand der Kristallstruktur des hGH-Komplexes mit dem dimerisierten Rezeptor (GHR)
• 8 kombinatorisch generierte Mutationen an der ersten Bindungsstelle führen zu erhöhter Affinität für den hGHR
• Eine Punktmutation in der zweiten, von sich aus schon schwächeren Bindungsstelle verhindert die Rezeptordimerisierung und unterbindet damit die Signalauslösung

Derivatisierung mit 4-6 PEG-Ketten zur Verlängerung der Serumhalbwertszeit

Übertragung der Creutzfeld-Jakob Krankheit aus human gewonnenem GH

Pegvisomant: Behandlung von Akromegalie