KF-Nukleinsäureanalytik at TU Dresden | Flashcards & Summaries

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Lernmaterialien für KF-Nukleinsäureanalytik an der TU Dresden

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TESTE DEIN WISSEN

Woraus ergibt sich die negative Ladung von Nucleinsäuren? Wird die Ladung durch die Bildung von Doppelhelices beeinflusst? Wie reagiert die Ladung auf Veränderungen des pH-Wertes im umgebenden Medium?

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  • Ergibt sich aus der Phosphatgruppe
  • Die Ladung korreliert mit der Molekülgröße
  • Sie ist über einen breiten pH-Bereich stabil
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Welche Merkmale bestimmen die Identität einer Nucleinsäure? Was versteht man unter der Konformation einer Nucleinsäure?


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TESTE DEIN WISSEN
  • Die Identität wird bestimmt durch Bausteine und Sequenz, sowie die dreidimensionale Struktur
  • Konformation: dreidimensionale Struktur der DNS
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TESTE DEIN WISSEN

Welche Vorteile machen die (gel)elektrophoretische Trennung mit gekoppelter Nucleinsäurefärbung zur praktisch bedeutendsten Methode der Analyse von Nucleinsäuren?


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Schnelle Durchführung, geringe Mengen an Material ist nötig, dadurch günstig, hohe Genauigkeit und ein breiter Größenbereich

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Was versteht man unter dem Begriff Elektrophorese? Welches generelle Merkmal müssen Teilchen aufweisen, damit eine elektrophoretische Trennung möglich ist?

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  • Wanderung geladener Teilchen unter dem Einfluss eines Gleichstroms (elektrisches Feld)
  • Moleküle/Teilchen müssen eine Ladung besitzen
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Was versteht man unter der elektrophoretischen Beweglichkeit eines Teilchens? Wie ist diese definiert? Welche Bedeutung haben die Parameter der Formel, die die elektrophoretische Beweglichkeit beschreibt? Welche Rückschlüsse ergeben sich daraus, dass die Ladung im Zähler bzw. der Teilchenradius im Nenner der Gleichung zu finden sind?


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  • Wanderungsgeschwindigkeit eines Moleküls innerhalb eines elektrischen Felds
  • µe ist der Quotient aus z*e (Ladungen des Teilchens) und 6*pi*r (Molekülradius)*n (Viskosität des Materials indem sich die Teilchen befinden)
  • Teilchen mit mehr Ladung wandern schneller als solche mit geringerer Ladung, besitzen Moleküle die gleiche Ladung, dann migrieren kleinere schneller als größere
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Welches Material ersetzt bei der Trägerelektrophorese die freie Pufferlösung? Aus welchem Polymer wird es für die Nucleinsäureanalytik überwiegend erzeugt? Woher stammt das Polymer, welcher Stoffgruppe gehört es an?


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  • Agarosegel 
  • Agarose
  • natürliches Polysaccharid aus roten Meeresalgen
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Durch welchen Vorgang entstehen aus Agaroselösungen feste Gele? Welche Eigenschaften weisen die Gele auf? Wovon hängt die Porengröße im Gel ab? Was versteht man unter Elektroendosmose? Welche Auswirkungen hat diese auf die elektrophoretische Trennung von Molekülen im Gel? Welche Bedingung entscheidet, ob eine Elektroendosmose stärker oder schwächer ausfällt?


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TESTE DEIN WISSEN
  • Thermogelation
  • Durch Aufkochen in Wasser bzw. Pufferlösung und anschließendes Abkühlen bildet Agarose Gele mit hoher Stabilität und großen Porendurchmessern
  • Porendurchmesser hängt von der Konzentration von Agarose ab
  • Strömung der flüssigen Phase, die entsteht, wenn positiv geladene Teilchen (neutralisieren die negative Ladung der Agarose) Richtung Kathode wandern
  • Verzerrungen und Verdünnungen der Zonen
  • Abhängig vom verwendeten Agarosegeltyp
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Welche technischen Instrumente werden benötigt, um eine Trägerelektrophorese durchzuführen? Welchen Leistungsbereich muss der Stromgeber abdecken? Werden eher hohe oder niedrige Feldstärken benötigt? Welche Kühlsysteme können genutzt werden? Warum ist es nicht sinnvoll, die Gelelektrophorese einfach in einer Kühlkammer durchzuführen? Wie sind vertikale und horizontale Gelkammern prinzipiell aufgebaut? Welches System wird für die Trennung von Nucleinsäuren bevorzugt? Worin liegen die Vorteile?


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TESTE DEIN WISSEN
  • Stromversorger, Kühlthermostat und Elektrophoresekammer
  • 200 bis 5000V und 400 bis 150mA
  • Hohe Feldstärken, deswegen müssen hohe Spannungen angelegt werden
  • Direkt über Kühlplatten oder indirekt über das Puffersystem
  • Luft kein guter Wärmeleiter
  •  

    Vertikal 

    Horizontal

    Aufbau

    Trennstrecke vollständig von Glasplatten oder in Glasröhrchen eingeschlossen und in Puffer eingelegt, Proben werden oben in Taschenförmige Vertiefungen aufgetragen. Die Kammer ist an eine Stromquelle angeschlossen

    Die Oberfläche der Trennstrecke ist offen, Gel horizontal und mit Puffer übergossen, Proben werden in Probenwannen pipettiert. Die Kammer ist an eine Stromquelle angeschlossen

    Vorteile

     

    - Keine großen Puffervolumina oder Tanks erforderlich, mit in Puffer getränkten Filterpapierstreifen möglich

    - Keine Probleme mit Abdichtung der Pufferkammern, keine Glasplatten und Abstandhalter erforderlich

    - dünnere Trennschichten können verwendet werden, dadurch effektivere Kühlung, schnellere Läufe und schärfere Zonen

    Welches System wird bei Nukleinsäuren verwendet?

    :(

    :)

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Warum entscheidet bei Nucleinsäuren nur die effektive Größe über das Laufverhalten im Gel? Welche Eigenschaften der Nucleinsäuren beeinflussen die effektive Größe? Wie unterscheidet sich das Laufverhalten entspannter zirkulärer, linearer und superhelicaler DNA? Wann findet man diese Konformationen? Wie leitet sich bei linearer DNA die Fragmentgröße aus der Laufstrecke im Trenngel ab? Welche Parameter beeinflussen das Laufverhalten von Nucleinsäuren in der Gelelektrophorese außerdem? Was sind sinnvolle Bereiche für Agarosekonzentration und Spannung?

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  • Verhältnis von Molekulargewicht zur Ladung ist konstant, deswegen hat die Ladung keinen Einfluss auf das Laufverhalten
  • Die effektive Größe wird bestimmt durch Sequenzlänge und Form
  • Laufverhalten: entspannt zirkulär < linear < superhelical
  • Unterschiedliche Organismen haben verschiedene DNA
  • Relative Strecke, die lineare DNA im Gel zurücklegt ist proportional zu dem dekadischen Logarithmus der Fragmentlänge
  • Gelkonzentration, Spannung, Puffersystem und die Ionenkonzentration des Puffer
  • 1-1,5% Agarosekonzentration, 5V*cm^-1 Spannung
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Was versteht man bei der Gelelektrophorese unter dem Marker? Wozu dient er? Was muss beachtete werden, damit die Mitführung des Markers die gewünschte Aussagekraft hat? Wovon hängt die Wahl des verwendeten Markers ab?


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  • Trennung großer DNA-Fragmente mittels häufiger Richtungsänderungen des elektrischen Felds
  • CHEF-Methode: Feldelektroden sind hexagonal zum Gel angeordnet und das elektrische Feld wird durch Kontrollgerät zwischen einander gegenüberliegenden Elektroden angelegt, die Feldorientierung ändert sich jeweils um 60°. Richtung des Gleichstromfeldes wird periodisch verändert, dadurch werden die Moleküle in einer räumlich kompakten Form gehalten, die die ladungsabhängige Wanderung in der Hauptrichtung erlaubt
  • Zwischen 10h bis hin zu mehreren Tagen
  • Bei sehr langen DNA-Molekülen von mehr als 20 Kilobasen
  • Sie werden entlang des Feldes ausgerichtet und in Richtung Anode gezogen, da, wie in der Reptationstheorie beschrieben, DNA-Moleküle in Abwesenheit eines elektrischen Feldes in einer relaxierten, globulierten Form vorliegen, während bei Anliegen des elektrischen Felds die Trennung möglich gemacht wird. Kleinere Moleküle brauchen proportional zu ihrer Größe weniger Zeit zur Relaxation und zur Reorientierung und haben dadurch mehr Zeit zur Wanderung als größere Moleküle.
  • Das Ergebnis sind relativ unscharfe Flecken
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Welche zwei prinzipiellen Ansätze gibt es, Nucleinsäuren innerhalb eines Agarosegels sichtbar zu machen? Was versteht man unter Interkalierung? Welcher interkalierende Farbstoff wird in der Nucleinsäureanalytik (noch) am häufigsten gebraucht? Wie erfolgt die Detektion? Welche Nucleinsäuretypen können damit sichtbar gemacht werden? Welche DNA-Mengen lassen sich damit nachweisen? Wovon hängt die Sensitivität des Nachweises ab? Welche Nebenwirkungen hat der Einsatz des interkalierenden Farbstoffs auf das Laufverhalten der Nucleinsäure? Weshalb gibt es Bestrebungen, den Einsatz dieses Farbstoffs im Labor zu vermeiden? Welche Alternativen, die nach demselben Prinzip funktionieren, gibt es? Wie unterscheiden sich diese vom zuvor diskutierten „Standardfarbstoff“?


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  • Interkalierung (Einlagerung von fluoreszierenden Farbstoffen) und Silberfärbung
  • Ethidium Bromid
  • Der Farbstoff kann durch UV-Licht einer Wellenlänge von 254nm-366nm angeregt werden und emittiert Licht im Orange-Roten Bereich bei 590nm
  • Interkaliert bevorzugt in doppelsträngiger DNA (wechselwirkt mit planaren Heterozyklen der Basen)
  • 10-20ng
  • Sensitivität variiert mit Fragmentlänge (je kleiner, desto ungenauer)
  • Zugabe verlangsamt die Laufgeschwindigkeit von der Probe um ca. 15%; Das für die Fluoreszenz verantwortliche Ethidium-Kation wandert während der Elektrophorese zur Kathode, deshalb Nachdosierung nötig
  • Neue Farbstoffe sensitiver und weniger mutagen
  • SYBR Green

    Wird bei einer Wellenlänge von 492nm angeregt und emittiert Licht bei 519nm, eignet sich dadurch auch zur Quantifizierung in Fluoreszenz-Messgeräten (durch Vergleich mit einer Färbung von Konzentrationen bei bekannten Nukleinsäuren)

    SYBR Green 2 & OLI Green

    Deutliche Verbesserungen bei Färbung von einzelsträngigen Nukleinsäuren

    TOTO-1 & YOYO-1

    Binden mit höherer Affinität und ermöglichen somit höhere Sensitivität

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Aus welchen Grundbausteinen bestehen Nucleinsäuren? Welche molekularen Merkmale weisen diese auf? Durch welche Bindungstypen entstehen Ketten und Doppelhelices?

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  • Nukleinbasen (zyklische Ringverbindungen), Zucker (entweder Desoxyribose oder Ribose), und Phosphorsäuremoleküle. Nukleoside sind über eine Phosphorsäure zu linearen Ketten verknüpft
  • Die Basen sind zueinander komplementär und können sich zu Helices zusammenlegen. Durch die Phosphatgruppe im Säurerückgrat ist das Molekül stark negativ geladen (Ladung korreliert mit Molekülgröße, über breiten pH-Bereich stabil)
  • Wasserstoffbrücken (basenspezifische Hybridisierung)
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  • 186847 Karteikarten
  • 3607 Studierende
  • 150 Lernmaterialien

Beispielhafte Karteikarten für deinen KF-Nukleinsäureanalytik Kurs an der TU Dresden - von Kommilitonen auf StudySmarter erstellt!

Q:

Woraus ergibt sich die negative Ladung von Nucleinsäuren? Wird die Ladung durch die Bildung von Doppelhelices beeinflusst? Wie reagiert die Ladung auf Veränderungen des pH-Wertes im umgebenden Medium?

A:
  • Ergibt sich aus der Phosphatgruppe
  • Die Ladung korreliert mit der Molekülgröße
  • Sie ist über einen breiten pH-Bereich stabil
Q:

Welche Merkmale bestimmen die Identität einer Nucleinsäure? Was versteht man unter der Konformation einer Nucleinsäure?


A:
  • Die Identität wird bestimmt durch Bausteine und Sequenz, sowie die dreidimensionale Struktur
  • Konformation: dreidimensionale Struktur der DNS
Q:

Welche Vorteile machen die (gel)elektrophoretische Trennung mit gekoppelter Nucleinsäurefärbung zur praktisch bedeutendsten Methode der Analyse von Nucleinsäuren?


A:

Schnelle Durchführung, geringe Mengen an Material ist nötig, dadurch günstig, hohe Genauigkeit und ein breiter Größenbereich

Q:

Was versteht man unter dem Begriff Elektrophorese? Welches generelle Merkmal müssen Teilchen aufweisen, damit eine elektrophoretische Trennung möglich ist?

A:
  • Wanderung geladener Teilchen unter dem Einfluss eines Gleichstroms (elektrisches Feld)
  • Moleküle/Teilchen müssen eine Ladung besitzen
Q:

Was versteht man unter der elektrophoretischen Beweglichkeit eines Teilchens? Wie ist diese definiert? Welche Bedeutung haben die Parameter der Formel, die die elektrophoretische Beweglichkeit beschreibt? Welche Rückschlüsse ergeben sich daraus, dass die Ladung im Zähler bzw. der Teilchenradius im Nenner der Gleichung zu finden sind?


A:
  • Wanderungsgeschwindigkeit eines Moleküls innerhalb eines elektrischen Felds
  • µe ist der Quotient aus z*e (Ladungen des Teilchens) und 6*pi*r (Molekülradius)*n (Viskosität des Materials indem sich die Teilchen befinden)
  • Teilchen mit mehr Ladung wandern schneller als solche mit geringerer Ladung, besitzen Moleküle die gleiche Ladung, dann migrieren kleinere schneller als größere
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Q:

Welches Material ersetzt bei der Trägerelektrophorese die freie Pufferlösung? Aus welchem Polymer wird es für die Nucleinsäureanalytik überwiegend erzeugt? Woher stammt das Polymer, welcher Stoffgruppe gehört es an?


A:
  • Agarosegel 
  • Agarose
  • natürliches Polysaccharid aus roten Meeresalgen
Q:

Durch welchen Vorgang entstehen aus Agaroselösungen feste Gele? Welche Eigenschaften weisen die Gele auf? Wovon hängt die Porengröße im Gel ab? Was versteht man unter Elektroendosmose? Welche Auswirkungen hat diese auf die elektrophoretische Trennung von Molekülen im Gel? Welche Bedingung entscheidet, ob eine Elektroendosmose stärker oder schwächer ausfällt?


A:
  • Thermogelation
  • Durch Aufkochen in Wasser bzw. Pufferlösung und anschließendes Abkühlen bildet Agarose Gele mit hoher Stabilität und großen Porendurchmessern
  • Porendurchmesser hängt von der Konzentration von Agarose ab
  • Strömung der flüssigen Phase, die entsteht, wenn positiv geladene Teilchen (neutralisieren die negative Ladung der Agarose) Richtung Kathode wandern
  • Verzerrungen und Verdünnungen der Zonen
  • Abhängig vom verwendeten Agarosegeltyp
Q:

Welche technischen Instrumente werden benötigt, um eine Trägerelektrophorese durchzuführen? Welchen Leistungsbereich muss der Stromgeber abdecken? Werden eher hohe oder niedrige Feldstärken benötigt? Welche Kühlsysteme können genutzt werden? Warum ist es nicht sinnvoll, die Gelelektrophorese einfach in einer Kühlkammer durchzuführen? Wie sind vertikale und horizontale Gelkammern prinzipiell aufgebaut? Welches System wird für die Trennung von Nucleinsäuren bevorzugt? Worin liegen die Vorteile?


A:
  • Stromversorger, Kühlthermostat und Elektrophoresekammer
  • 200 bis 5000V und 400 bis 150mA
  • Hohe Feldstärken, deswegen müssen hohe Spannungen angelegt werden
  • Direkt über Kühlplatten oder indirekt über das Puffersystem
  • Luft kein guter Wärmeleiter
  •  

    Vertikal 

    Horizontal

    Aufbau

    Trennstrecke vollständig von Glasplatten oder in Glasröhrchen eingeschlossen und in Puffer eingelegt, Proben werden oben in Taschenförmige Vertiefungen aufgetragen. Die Kammer ist an eine Stromquelle angeschlossen

    Die Oberfläche der Trennstrecke ist offen, Gel horizontal und mit Puffer übergossen, Proben werden in Probenwannen pipettiert. Die Kammer ist an eine Stromquelle angeschlossen

    Vorteile

     

    - Keine großen Puffervolumina oder Tanks erforderlich, mit in Puffer getränkten Filterpapierstreifen möglich

    - Keine Probleme mit Abdichtung der Pufferkammern, keine Glasplatten und Abstandhalter erforderlich

    - dünnere Trennschichten können verwendet werden, dadurch effektivere Kühlung, schnellere Läufe und schärfere Zonen

    Welches System wird bei Nukleinsäuren verwendet?

    :(

    :)

Q:

Warum entscheidet bei Nucleinsäuren nur die effektive Größe über das Laufverhalten im Gel? Welche Eigenschaften der Nucleinsäuren beeinflussen die effektive Größe? Wie unterscheidet sich das Laufverhalten entspannter zirkulärer, linearer und superhelicaler DNA? Wann findet man diese Konformationen? Wie leitet sich bei linearer DNA die Fragmentgröße aus der Laufstrecke im Trenngel ab? Welche Parameter beeinflussen das Laufverhalten von Nucleinsäuren in der Gelelektrophorese außerdem? Was sind sinnvolle Bereiche für Agarosekonzentration und Spannung?

A:
  • Verhältnis von Molekulargewicht zur Ladung ist konstant, deswegen hat die Ladung keinen Einfluss auf das Laufverhalten
  • Die effektive Größe wird bestimmt durch Sequenzlänge und Form
  • Laufverhalten: entspannt zirkulär < linear < superhelical
  • Unterschiedliche Organismen haben verschiedene DNA
  • Relative Strecke, die lineare DNA im Gel zurücklegt ist proportional zu dem dekadischen Logarithmus der Fragmentlänge
  • Gelkonzentration, Spannung, Puffersystem und die Ionenkonzentration des Puffer
  • 1-1,5% Agarosekonzentration, 5V*cm^-1 Spannung
Q:

Was versteht man bei der Gelelektrophorese unter dem Marker? Wozu dient er? Was muss beachtete werden, damit die Mitführung des Markers die gewünschte Aussagekraft hat? Wovon hängt die Wahl des verwendeten Markers ab?


A:
  • Trennung großer DNA-Fragmente mittels häufiger Richtungsänderungen des elektrischen Felds
  • CHEF-Methode: Feldelektroden sind hexagonal zum Gel angeordnet und das elektrische Feld wird durch Kontrollgerät zwischen einander gegenüberliegenden Elektroden angelegt, die Feldorientierung ändert sich jeweils um 60°. Richtung des Gleichstromfeldes wird periodisch verändert, dadurch werden die Moleküle in einer räumlich kompakten Form gehalten, die die ladungsabhängige Wanderung in der Hauptrichtung erlaubt
  • Zwischen 10h bis hin zu mehreren Tagen
  • Bei sehr langen DNA-Molekülen von mehr als 20 Kilobasen
  • Sie werden entlang des Feldes ausgerichtet und in Richtung Anode gezogen, da, wie in der Reptationstheorie beschrieben, DNA-Moleküle in Abwesenheit eines elektrischen Feldes in einer relaxierten, globulierten Form vorliegen, während bei Anliegen des elektrischen Felds die Trennung möglich gemacht wird. Kleinere Moleküle brauchen proportional zu ihrer Größe weniger Zeit zur Relaxation und zur Reorientierung und haben dadurch mehr Zeit zur Wanderung als größere Moleküle.
  • Das Ergebnis sind relativ unscharfe Flecken
Q:

Welche zwei prinzipiellen Ansätze gibt es, Nucleinsäuren innerhalb eines Agarosegels sichtbar zu machen? Was versteht man unter Interkalierung? Welcher interkalierende Farbstoff wird in der Nucleinsäureanalytik (noch) am häufigsten gebraucht? Wie erfolgt die Detektion? Welche Nucleinsäuretypen können damit sichtbar gemacht werden? Welche DNA-Mengen lassen sich damit nachweisen? Wovon hängt die Sensitivität des Nachweises ab? Welche Nebenwirkungen hat der Einsatz des interkalierenden Farbstoffs auf das Laufverhalten der Nucleinsäure? Weshalb gibt es Bestrebungen, den Einsatz dieses Farbstoffs im Labor zu vermeiden? Welche Alternativen, die nach demselben Prinzip funktionieren, gibt es? Wie unterscheiden sich diese vom zuvor diskutierten „Standardfarbstoff“?


A:
  • Interkalierung (Einlagerung von fluoreszierenden Farbstoffen) und Silberfärbung
  • Ethidium Bromid
  • Der Farbstoff kann durch UV-Licht einer Wellenlänge von 254nm-366nm angeregt werden und emittiert Licht im Orange-Roten Bereich bei 590nm
  • Interkaliert bevorzugt in doppelsträngiger DNA (wechselwirkt mit planaren Heterozyklen der Basen)
  • 10-20ng
  • Sensitivität variiert mit Fragmentlänge (je kleiner, desto ungenauer)
  • Zugabe verlangsamt die Laufgeschwindigkeit von der Probe um ca. 15%; Das für die Fluoreszenz verantwortliche Ethidium-Kation wandert während der Elektrophorese zur Kathode, deshalb Nachdosierung nötig
  • Neue Farbstoffe sensitiver und weniger mutagen
  • SYBR Green

    Wird bei einer Wellenlänge von 492nm angeregt und emittiert Licht bei 519nm, eignet sich dadurch auch zur Quantifizierung in Fluoreszenz-Messgeräten (durch Vergleich mit einer Färbung von Konzentrationen bei bekannten Nukleinsäuren)

    SYBR Green 2 & OLI Green

    Deutliche Verbesserungen bei Färbung von einzelsträngigen Nukleinsäuren

    TOTO-1 & YOYO-1

    Binden mit höherer Affinität und ermöglichen somit höhere Sensitivität

Q:

Aus welchen Grundbausteinen bestehen Nucleinsäuren? Welche molekularen Merkmale weisen diese auf? Durch welche Bindungstypen entstehen Ketten und Doppelhelices?

A:
  • Nukleinbasen (zyklische Ringverbindungen), Zucker (entweder Desoxyribose oder Ribose), und Phosphorsäuremoleküle. Nukleoside sind über eine Phosphorsäure zu linearen Ketten verknüpft
  • Die Basen sind zueinander komplementär und können sich zu Helices zusammenlegen. Durch die Phosphatgruppe im Säurerückgrat ist das Molekül stark negativ geladen (Ladung korreliert mit Molekülgröße, über breiten pH-Bereich stabil)
  • Wasserstoffbrücken (basenspezifische Hybridisierung)
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