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Lernmaterialien für ZKT 5. Semester an der ZHAW - Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften

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TESTE DEIN WISSEN

Sind Säugerzelllinien wie CHO, BHK, MDCK und NS0 finite oder permanente Säugerzelllinien? Erklären Sie den Unterschied zwischen finit und permanent.

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TESTE DEIN WISSEN

Sie sind permanent:

- unbeschränkt wachstumsfähige Zellkulturen (entstanden durch spontane oder chemisch bzw. viral induzierte Zelltransformation)


finite: verlieren metabolische Aktivität mit jeder Passage, Seneszenz (stellen nach bestimmter Anzahl von Zellteilungen in Zellkultur das Wachstum ein)

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Welches Antibiotika inhibiert Wachstum grampositiver und welches gramnegativer Bakterien?

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Penicillin: grampositiv

Streptomycin: gramnegativ

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Wie kann die Zelldichte bestimmt werden?

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manuelle Bestimmung mit Trypanblau


-> tote Zellen nehmen Farbstoff auf, lebende farblos

-> Achtung! Trypanblau Toxisch, Messung innerhalb von 5 MInuten abschliessen


1) 4 von 9 Grossquadraten auszählen (entscheiden wo die auf Linie gehören zB immer nur im oberen gezählt, immer nur links)

2) Gesamtzellzahl dann Lebendzellzahl bestimmen, festhalten und Mittelwert bilden


automatisierte Zelldichtbestimmung (Cedes HiREs oder Nucleocounter)

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Nennen Sie 3 Beispiele für mAb Produkte:

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Infliximab (chimerer AK) von Johnson & Johnson bei Gelenkentzündungen und chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen


Adalimumab (U-mab steht für humanisierte oder vollständig humane AK) vonn AbbVie bei Gelenkentzündungen


Avastin (Bevacizumab) von Roche bei Darmkrebs


-> Blockbuster Produkte, spielen mehr als 1 Mrd. Dollar pro Jahr ein.


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Wie funktioniert Trypsinierung?

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1) Trypsin vorwärmen

2) altes Medium raus

3) Zellen mit PBS waschen (Trypsinhemmer entfernen)

4) max. 10 Minuten einwirken -> mikroskopisch beobachten ob Zellen schwimmen (klopfen)

5) Zentrifugation um PBS abzutrennen

6) frisches Medium dazu und gewünschte Zelldichte einstellen

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Welche Arten zur Substrat- und Metabolitenmonitoring gibt es?

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1) BioProfile (innerhalb 2 Minuten)

2) Cedex Bio (ca 20 Minuten)

Misst u.a.:

Glukose

Laktat

Glutamin/Glutamat

NH4+

Eisen

Magnesium

Ammonium

IgG

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Wie wirkt Glutamin im Medium?

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Glutamin

1) wirkt als Energie- und N-Quelle. Wenn Glukose fehlt wird sie der neue Energielieferant. 

2) ist Precursor für Vorstufe von Purinen, Aminozuckern und Asparaginen 

3) Hauptmetabolit bei Umsetzung von Glutamin ist Ammonium, welches ab bestimmten Konzentrationen inhibierend auf Zellwachstum wirkt. Aus diesem Grund könnte man z.B. Ultraglutamine fürs Medium benutzen (eine stabile Form, welche nicht zu Ammonium degradiert)

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Welche Anforderungen an den Kultivierungsprozess stellen Säugerzellen?

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1) keine grossen Scherkräfte und Regelung des Energieeintrags, da nur eine Zellmembran vorhanden (keine Zellwand)

2) Wachstumsform als Monolayer oder Einzelzellen

3) Da kleine Wachstumsrate (Verdopplungszeit um 24h) sterile Betriebsweise über Wochen und Monate (Trend von Fed-Batch zu kontinuierlich)

4) Geringe Belüftungsraten und Blasenbelüftung (mehr Sauerstoff bei hohen Zelldichten) 2-10*10^12 g O2 pro Zelle*h

5) Zweiphasenprozess mit Temperaturshift 37°C für Wachstum, 28°C-34°C für Produktion (Achtung dass tiefe Temp keinen negativen Einfluss auf Produkttiter hat)

6) pH-Optimum zwischen 7.0 und 7.4, Regelung des pH's: CO2 als Säure über Zuluft, Bicarbonat im Medium als Lauge

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Was ist ein Gyloxalat-Zyklus?

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Variante des Zitratzyklus wo Acetat zu Oxalacetat umgesetzt wird

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Wie wirkt Ammonium aufs Zellwachstum?

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1) wirkt inhibierend auf Wachstum und beeinträchtigt Produktqualität


2) bereits ab 4 mmol/L Wachstumsinhibierung aufgrund Übersäuerung des Cytoplasmas (intrazellulärer pH runter)


3) zwsichen 5-6mmol/L sogar bis 50% reduziertes Zellwachstum

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Was sind die zellulären Bausteine Eukaryotischer Zellen?

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- Zucker

- Fettsäuren

- Aminosäuren

- Nukleotide

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Welche Beispiele für permanente Zellkulturen gibt es?

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Tumorzellen

Hybridomzellen (fusionierte Milzzellen und Knochenmarkstumorzellen)

Transfizierte Zellen (Fremd-DNA eingebracht)

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Q:

Sind Säugerzelllinien wie CHO, BHK, MDCK und NS0 finite oder permanente Säugerzelllinien? Erklären Sie den Unterschied zwischen finit und permanent.

A:

Sie sind permanent:

- unbeschränkt wachstumsfähige Zellkulturen (entstanden durch spontane oder chemisch bzw. viral induzierte Zelltransformation)


finite: verlieren metabolische Aktivität mit jeder Passage, Seneszenz (stellen nach bestimmter Anzahl von Zellteilungen in Zellkultur das Wachstum ein)

Q:

Welches Antibiotika inhibiert Wachstum grampositiver und welches gramnegativer Bakterien?

A:

Penicillin: grampositiv

Streptomycin: gramnegativ

Q:

Wie kann die Zelldichte bestimmt werden?

A:

manuelle Bestimmung mit Trypanblau


-> tote Zellen nehmen Farbstoff auf, lebende farblos

-> Achtung! Trypanblau Toxisch, Messung innerhalb von 5 MInuten abschliessen


1) 4 von 9 Grossquadraten auszählen (entscheiden wo die auf Linie gehören zB immer nur im oberen gezählt, immer nur links)

2) Gesamtzellzahl dann Lebendzellzahl bestimmen, festhalten und Mittelwert bilden


automatisierte Zelldichtbestimmung (Cedes HiREs oder Nucleocounter)

Q:

Nennen Sie 3 Beispiele für mAb Produkte:

A:

Infliximab (chimerer AK) von Johnson & Johnson bei Gelenkentzündungen und chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen


Adalimumab (U-mab steht für humanisierte oder vollständig humane AK) vonn AbbVie bei Gelenkentzündungen


Avastin (Bevacizumab) von Roche bei Darmkrebs


-> Blockbuster Produkte, spielen mehr als 1 Mrd. Dollar pro Jahr ein.


Q:

Wie funktioniert Trypsinierung?

A:

1) Trypsin vorwärmen

2) altes Medium raus

3) Zellen mit PBS waschen (Trypsinhemmer entfernen)

4) max. 10 Minuten einwirken -> mikroskopisch beobachten ob Zellen schwimmen (klopfen)

5) Zentrifugation um PBS abzutrennen

6) frisches Medium dazu und gewünschte Zelldichte einstellen

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Q:

Welche Arten zur Substrat- und Metabolitenmonitoring gibt es?

A:

1) BioProfile (innerhalb 2 Minuten)

2) Cedex Bio (ca 20 Minuten)

Misst u.a.:

Glukose

Laktat

Glutamin/Glutamat

NH4+

Eisen

Magnesium

Ammonium

IgG

Q:

Wie wirkt Glutamin im Medium?

A:

Glutamin

1) wirkt als Energie- und N-Quelle. Wenn Glukose fehlt wird sie der neue Energielieferant. 

2) ist Precursor für Vorstufe von Purinen, Aminozuckern und Asparaginen 

3) Hauptmetabolit bei Umsetzung von Glutamin ist Ammonium, welches ab bestimmten Konzentrationen inhibierend auf Zellwachstum wirkt. Aus diesem Grund könnte man z.B. Ultraglutamine fürs Medium benutzen (eine stabile Form, welche nicht zu Ammonium degradiert)

Q:

Welche Anforderungen an den Kultivierungsprozess stellen Säugerzellen?

A:

1) keine grossen Scherkräfte und Regelung des Energieeintrags, da nur eine Zellmembran vorhanden (keine Zellwand)

2) Wachstumsform als Monolayer oder Einzelzellen

3) Da kleine Wachstumsrate (Verdopplungszeit um 24h) sterile Betriebsweise über Wochen und Monate (Trend von Fed-Batch zu kontinuierlich)

4) Geringe Belüftungsraten und Blasenbelüftung (mehr Sauerstoff bei hohen Zelldichten) 2-10*10^12 g O2 pro Zelle*h

5) Zweiphasenprozess mit Temperaturshift 37°C für Wachstum, 28°C-34°C für Produktion (Achtung dass tiefe Temp keinen negativen Einfluss auf Produkttiter hat)

6) pH-Optimum zwischen 7.0 und 7.4, Regelung des pH's: CO2 als Säure über Zuluft, Bicarbonat im Medium als Lauge

Q:

Was ist ein Gyloxalat-Zyklus?

A:

Variante des Zitratzyklus wo Acetat zu Oxalacetat umgesetzt wird

Q:

Wie wirkt Ammonium aufs Zellwachstum?

A:

1) wirkt inhibierend auf Wachstum und beeinträchtigt Produktqualität


2) bereits ab 4 mmol/L Wachstumsinhibierung aufgrund Übersäuerung des Cytoplasmas (intrazellulärer pH runter)


3) zwsichen 5-6mmol/L sogar bis 50% reduziertes Zellwachstum

Q:

Was sind die zellulären Bausteine Eukaryotischer Zellen?

A:

- Zucker

- Fettsäuren

- Aminosäuren

- Nukleotide

Q:

Welche Beispiele für permanente Zellkulturen gibt es?

A:

Tumorzellen

Hybridomzellen (fusionierte Milzzellen und Knochenmarkstumorzellen)

Transfizierte Zellen (Fremd-DNA eingebracht)

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