Mikrobiologie und Genetik an der Universität Wien

Karteikarten und Zusammenfassungen für Mikrobiologie und Genetik an der Universität Wien

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Die Wahl des Verfahrens der Aufschlussmethode ist abhängig von?

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Aufschlussmethoden sind?

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Herausforderungen der DNA-Isolierung

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Anzahl der Chromosome + Größe des Genoms in Basenpaaren beim Menschen und der Maus

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Was machen DNasen und RNasen

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Wie erfolgt die DNA Isolierung?

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Nenne Denaturierungssubstanzen

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Wie können Proteine von Zellrückstände Abgetrennt werden?

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DNA ist positiv geladen durch das Phophatrückgrat und löslich in organischen Lebensmittel 

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Wie erfolgt die Organische Extraktion?

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Was ist die Ethanolfällung?

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Welche Fällungsmethoden gibt es noch?

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Mikrobiologie und Genetik

Die Wahl des Verfahrens der Aufschlussmethode ist abhängig von?

  • Art des Probenmaterials (Pflanzen, tierisches Gewebe, Insekten
  • zu isolierende Probenmenge
  • Probenzahl (paralleler Aufschluss mehrerer Proben)

Mikrobiologie und Genetik

Aufschlussmethoden sind?

  • Ultraschall
  • osmotisches Verfahren
  • Freeze-Thaw Verfahren
  • Mörser und Pistill
  • Kugelmühlen
  • Blender

Mikrobiologie und Genetik

Herausforderungen der DNA-Isolierung

  • DNA ist ein sehr langes homogenes Molekül, teilweise dicht gepackt
  • Fragmentierung sehr leicht möglich
  • Trennung von anderen zellulären Komponeneten (RNA,Proteine,Lipide,...)

Mikrobiologie und Genetik

Anzahl der Chromosome + Größe des Genoms in Basenpaaren beim Menschen und der Maus

Mensch 2x23 und 3,2x10^9

Maus 2x20 und 2,7x10^9

Mikrobiologie und Genetik

Was machen DNasen und RNasen

  • Bauen DNA(RNA)ab
  • DNasen einfacher zu inaktivieren (Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen --> +EDTA(organische Säure)
  • RNA-Aufreinigung mit DPEC, zusätzlich werden Glasgefäße für >8h auf 180°C gebacken
  • eigener Bereich ist nötig (möglichst steril)

Mikrobiologie und Genetik

Wie erfolgt die DNA Isolierung?

  • Lyse (Aufbrechen der Zelle /des Zellkerns) + Homgenisierung (detergenz)
  • Denaturierung von Proteinen und Nukleoprotein-Komplexen (PRotease/Denaturierungsagenz)
  • Inaktivierung von endogenen Nukleasen (sog. DNasen)
  • Isolierung und Aufreinigung der DNA (Abtrennung von Proteinen, RNAs,...)

Mikrobiologie und Genetik

Nenne Denaturierungssubstanzen

  • Ionische Detergentien(brechen hydrophobe Bindungen und Wasserstoffbrücken auf
  • Chaotrope Reagenzien (Harnstoff z.B. entfernen Hydrathüllenvon Biomolekülen, +geladene Salze können Salzbrücken bilden)
  • Reduzierende Agenzien (zum Aufbrechen von Disulfidbindungen)
  • Salze (Interagieren mit geladenen Gruppen und erhöhen die Proteinlöslichkeit)
  • Wärme (bricht Wsstbrücken und unpolare Bindungen)
  • (Protease und RNase)

Mikrobiologie und Genetik

Wie können Proteine von Zellrückstände Abgetrennt werden?

  • Organische Extraktion
  • Aussalzen/Fällung
  • Selektive Bindung von DNA und Sulchen

Mikrobiologie und Genetik

DNA ist positiv geladen durch das Phophatrückgrat und löslich in organischen Lebensmittel 

falsch

Mikrobiologie und Genetik

Wie erfolgt die Organische Extraktion?

  • Durch 1:1 Phenol:Chloroform oder 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl-Alkohol
  • Phenol denaturiert Proteine dies bewirkt die Bildung einer festen Interphase zwischen organischer und wässriger Phase
  • Chloroform erhöht die Dichte der organischen Phase
  • Isoamyl-Alkohol verhindert die Schaumbildung

Mikrobiologie und Genetik

Was ist die Ethanolfällung?

Am häufigsten verwendete Fällungsmethode. Ethanol entzieht der DNA die Hydrathülle, negativ geladene Phosphatgruppen bilden mit Na+ z.B. ein Salz

DNA wird Präzipitiert (Abscheidung der Flüssigkeit, sie fällt)

DNA/RNA liegen in konzentrierter Form vor

Überführung in neue Puffer ist möglich

Mikrobiologie und Genetik

Welche Fällungsmethoden gibt es noch?

Isopropanolfällung (nicht ganz so effizient wie Ethanolfällung)


PEG (Polyethylenglykol) Fällung (lässt sich nur schwer wieder enfernen und stört viele Enzymreaktionen)

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