Mikrobiologie Und Genetik an der Universität Wien

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Die Wahl des Verfahrens der Aufschlussmethode ist abhängig von?

Art des Probenmaterials (Pflanzen, tierisches Gewebe, Insekten
zu isolierende Probenmenge
Probenzahl (paralleler Aufschluss mehrerer Proben)

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Aufschlussmethoden sind?

Ultraschall
osmotisches Verfahren
Freeze-Thaw Verfahren
Mörser und Pistill
Kugelmühlen
Blender

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Herausforderungen der DNA-Isolierung

DNA ist ein sehr langes homogenes Molekül, teilweise dicht gepackt
Fragmentierung sehr leicht möglich
Trennung von anderen zellulären Komponeneten (RNA,Proteine,Lipide,...)

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Anzahl der Chromosome + Größe des Genoms in Basenpaaren beim Menschen und der Maus

Mensch 2x23 und 3,2x10^9

Maus 2x20 und 2,7x10^9

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Was machen DNasen und RNasen

Bauen DNA(RNA)ab
DNasen einfacher zu inaktivieren (Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen --> +EDTA(organische Säure)
RNA-Aufreinigung mit DPEC, zusätzlich werden Glasgefäße für >8h auf 180°C gebacken
eigener Bereich ist nötig (möglichst steril)

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Wie erfolgt die DNA Isolierung?

Lyse (Aufbrechen der Zelle /des Zellkerns) + Homgenisierung (detergenz)
Denaturierung von Proteinen und Nukleoprotein-Komplexen (PRotease/Denaturierungsagenz)
Inaktivierung von endogenen Nukleasen (sog. DNasen)
Isolierung und Aufreinigung der DNA (Abtrennung von Proteinen, RNAs,...)

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Nenne Denaturierungssubstanzen

Ionische Detergentien(brechen hydrophobe Bindungen und Wasserstoffbrücken auf
Chaotrope Reagenzien (Harnstoff z.B. entfernen Hydrathüllenvon Biomolekülen, +geladene Salze können Salzbrücken bilden)
Reduzierende Agenzien (zum Aufbrechen von Disulfidbindungen)
Salze (Interagieren mit geladenen Gruppen und erhöhen die Proteinlöslichkeit)
Wärme (bricht Wsstbrücken und unpolare Bindungen)
(Protease und RNase)

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Wie können Proteine von Zellrückstände Abgetrennt werden?

Organische Extraktion
Aussalzen/Fällung
Selektive Bindung von DNA und Sulchen

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DNA ist positiv geladen durch das Phophatrückgrat und löslich in organischen Lebensmittel

falsch

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Wie erfolgt die Organische Extraktion?

Durch 1:1 Phenol:Chloroform oder 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl-Alkohol
Phenol denaturiert Proteine dies bewirkt die Bildung einer festen Interphase zwischen organischer und wässriger Phase
Chloroform erhöht die Dichte der organischen Phase
Isoamyl-Alkohol verhindert die Schaumbildung

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Was ist die Ethanolfällung?

Am häufigsten verwendete Fällungsmethode. Ethanol entzieht der DNA die Hydrathülle, negativ geladene Phosphatgruppen bilden mit Na+ z.B. ein Salz

DNA wird Präzipitiert (Abscheidung der Flüssigkeit, sie fällt)

DNA/RNA liegen in konzentrierter Form vor

Überführung in neue Puffer ist möglich

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Welche Fällungsmethoden gibt es noch?

Isopropanolfällung (nicht ganz so effizient wie Ethanolfällung)

PEG (Polyethylenglykol) Fällung (lässt sich nur schwer wieder enfernen und stört viele Enzymreaktionen)

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