Biotechnologie an der Universität Rostock

1. Was sind Phytohormone?
   • Pflanzliche organische Substanzen, die bereits in sehr kleinen Konzentrationen wirksam sind & Wachstum & Entwicklung der Pflanzen steuern, vielfach in WW mit Umweltfaktoren.
2. 6 Klassen
   1. Auxine
   2. Cytokinine
   3. Abscisinsäure
   4. Ethylen
   5. Jasmonat
   6. Brassinosteroide
3. Begriffe erklären:
   1. Explantat
      • Gewebestück oder Organ, das zum Zweck der Gewebezüchtung oder der Transplantation aus einem Organismus entnommen wurde
   2. Callus
      • Wundgewebe, das i.d.R. ensteht, wenn eine Wunde junges Gewebe bloßlegt & die Wunden durch Überwallung geschlossen werden
      • wichtige Zwischenstufe bei der Anlage von Zell- / Organkulturen, entstanden als Wundgewebe; Calli können meist lange Zeit durch regelmäßige Passagen auf geeigneten Medien erhalten werden
      • Zellhaufen undifferenzierter, totipotenter Zellen
   3. Organogenese
      • Stufe der Zell- & Gewebedifferenzierung zur Ausbildung von Organen; kann in vitro durch Variation der Phytohormongemische ausgelöst werden
      • Differenzierung & Ausbildung von Organen
   4. somatische Embryogenese
      • Entstehung einer neuen Pflanze über einen Embryo, der sich aus einer vegetativen Zelle bildet
4. Verfahren beschreiben:
   1. Protoplastenfusion
      • über PEG (erleichtert Verschmelzung der Membranen) / Elektrofusion (über Stromschlag)
      • Elektrofusion: Gerät mit Kammer, Spannung anlegen, Stromschlag erzeugen, Zellen fusionieren
      • Hybrid hat Eigenschaften von beiden Organismen
      • Art des Hybrids hängt von den Eigenschaften der Eltern ab (symmetrisch, Cybrid, asymmetrisch)
      • Identifizierung der Fusionsprodukte
        • homo-/heterokaryotische Fusionen, Cybriden
        • Selektion über unterschiedliche Färbung (etiolierte & nicht etiolierte paaren), Vitalfarbstoffe, Inaktivierung von einem ZK durch Bestrahlung (nur Cybriden am Ende)
   2. Embryo Rescue Verfahren
      • Herauspräparieren des Embryos in verschiedenen frühen Entwicklungsstadien
      • Regeneration über Gewebekultur
      • je früher das Entwicklungsstadium, desto unwahrscheinlicher sind Probleme des Embryos mit dem Endosperm

1. 6 Klassen von Phytohormonen
   1. Auxine
   2. Cytokinine
   3. Abscisinsäure
   4. Ethylen
   5. Jasmonat
   6. Brassinosteroide
2. 3 Biosyntheseorte & 3 Wirkungsweisen
   1. ABA
      • Blätter & Früchte
      • Ausbildung Ruhe- & Alterszustände, Förderung Blattfall, Abtrennung Blüten & Früchte
   2. Ethylen
      • überall
      • Fruchtreifung, Hemmung des Streckungswachstums von Achsen & Wurzeln, Förderung von Alterszuständen
   3. Cytokinine
      • Wurzelspitzen
      • Förderung von Knospenaustrieb, Zellteilungen, Sprossregeneration
3. 2 Phytohormone für Regenerationsversuche im Praktikum = 6-BAP & IAA

maternale Gene

maternale Gene => zygotische Gene (Gap => Paarregel => Segmentpolarität)

- lieber zu viele Konstrukte, um aussagekräftiges Ergebnis sicherzustellen
- Vorteil ist es auch oft, 2 oder mehr unabhängige Experimente (mit unabhängigen Konstrukten) durchzuführen, um das Ergebnis zu beweisen
- nur 1 Gal4-Stamm => nur 1 Gewebe ausgeknockt
- Gen kann pleiotrop sein
- Bsp.: man kann evtl. dann nur die Herzfunktion entdecken, obwohl das Gen auch im Gehirn wirken könnte

• Virusabwehr
  • Zerstörung von Fremd-DNA
• Transposonabwehr
  • Schutz vor Transpositionsschäden (Retroviren)
• Genregulation
  • negative Regulation von eigenen Genen über miRNAs
  • > 1.000 miRNA-Gene bekannt

1. 4 Klassen von Phytohormonen
   1. Abscisinsäure
   2. Ethylen
   3. Cytokinine
   4. Brassinosteroide 
2. 3x Biosyntheseort & Wirkungen
   1. ABA
      • Blätter & Früchte
      • Ausbildung Ruhe- & Alterszustände, Förderung Blattfall, Abtrennung Blüten & Früchte
   2. Ethylen
      • überall
      • Fruchtreifung, Hemmung des Streckungswachstums von Achsen & Wurzeln, Förderung von Alterszuständen
   3. Cytokinine
      • Wurzelspitzen
      • Förderung von Knospenaustrieb, Zellteilungen, Sprossregeneration
3. 6-BAP & IAA in der Gewebekultur
   • 6-Benzylaminopurin (= Cytokinin) => Sprossbildung
   • Indol-3-Essigsäure (= Auxin) => Wurzelbildung

a.

Kreuzungen zwischen 2 Arten

b.

Problem: Biologische Definition einer Art (eine Art kann sich nur mit derselben Art fortpflanzen)

c.

1. Protoplastenfusion

• über PEG (erleichtert Verschmelzung der Membranen) / Elektrofusion (über Stromschlag)
• Elektrofusion: Gerät mit Kammer, Spannung anlegen, Stromschlag erzeugen, Zellen fusionieren
• Hybrid hat Eigenschaften von beiden Organismen
• Art des Hybrids hängt von den Eigenschaften der Eltern ab (symmetrisch, Cybrid, asymmetrisch)
• Identifizierung der Fusionsprodukte
  • homo-/heterokaryotische Fusionen, Cybriden
  • Selektion über unterschiedliche Färbung (etiolierte & nicht etiolierte paaren), Vitalfarbstoffe, Inaktivierung von einem ZK durch Bestrahlung (nur Cybriden am Ende)
  • für post-/präzygotische Inkompatibilität

1. Embryo Rescue Verfahren

• Herauspräparieren des Embryos in verschiedenen frühen Entwicklungsstadien
• Regeneration über Gewebekultur
• je früher das Entwicklungsstadium, desto unwahrscheinlicher sind Probleme des Embryos mit dem Endosperm
• für postzygotische Inkompatibilität

3 Methoden

• Embryo-Rescue-Verfahren

• Protoplastenfusion

• Dekapitierung von Narben

Methoden beschreiben, wann eingesetzt

• Protoplastenfusion

- über PEG (erleichtert Verschmelzung der Membranen) / Elektrofusion (über Stromschlag)

- Elektrofusion: Gerät mit Kammer, Spannung anlegen, Stromschlag erzeugen, Zellen fusionieren

- Hybrid hat Eigenschaften von beiden Organismen

- Art des Hybrids hängt von den Eigenschaften der Eltern ab (symmetrisch, Cybrid, asymmetrisch)

- Identifizierung der Fusionsprodukte (homo-/heterokaryotische Funktionen, Cybriden) 

- Selektion über unterschiedliche Färbung (etiolierte & nicht etiolierte paaren), Vitalfarbstoffe, Inaktivierung von einem ZK durch Bestrahlung (nur Cybriden am Ende)

-> post- / präzygotische Inkompatibilität

• Embryo Rescue Verfahren

- Herauspräparieren des Embryos in verschiedenen frühen Entwicklungsstadien

- Regeneration über Gewebekultur

- je früher das Entwicklungsstadium, desto unwahrscheinlicher sind Probleme des Embryos mit dem Endosperm

-> postzygotische Inkompatibilität

• Dekapitierung der Narben

- Signale des Stigmas lassen nur Pollen der gleichen Art auskeimen

- Narbe abschneiden, keine negativen Signale mehr

-> präzygotische Inkompatibilität

a. Transformation von Pflanzen

1. Agrobakterien

2. Particle Bombardement

b. Reportergen & Selektionsmarker

Reportergene => Erkennung transgener Zellen & Pflanzenteile, zB GUS

Selektionsmarker => Differenzierung zwischen transgenen & nicht-transgenen Regeneraten, zB Antibiotika-Selektion

c. Glyphosat hemmt die EPSPS

Glyphosat-Toleranz über

1. Überexpression EPSPS (5-Enolpyruvylshikimat-3-P-Synthase)

• Genamplifizierung - multiple Kopien (bis zu 20)
• Konstrukt: konstitutiver Promotor, pflanzeneigenes Gen
• CTP = cp Transit Peptide

2. Mutierte EPSP-Synthase

1. Hybrid im EPSPS-Gen: CTP, N-Terminus der Petunien-EPSPS, C-Terminus des mutierten E.-coli-Gens
2. Hybrid-EPSPS-Gen: CTP, mutiertes EPSPS-Gen - resistent gg Glyphosat, aber niedrieger Km-Wert für PEP => Roundup Ready, dikotyle Kulturpflanzen von Monsanto (Soja, Baumwolle, Raps) & Monokotyle

3. Detoxifizierung durch heterologe Gene

- Glyphosatoxidase (GOX) aus Ochrobactrum anthropi, Stamm LBAA

- + CTP vermittelt sehr gute Toleranz in Raps

- Kombi von CTP & GOX mit Agrobacterium-CP4-EPSPS: erhöhte Toleranz, keine Akkumulation des Herbizids

a. 

Kreuzungen zwischen 2 Arten

Problem: Biologische Definition einer Art (eine Art kann sich nur mit derselben Art fortpflanzen)

b. 

3 Methoden

Embryo-Rescue-Verfahren

Protoplastenfusion

Dekapitierung von Narben

c. 

Methoden beschreiben, wann eingesetzt

Protoplastenfusion

über PEG (erleichtert Verschmelzung der Membranen) / Elektrofusion (über Stromschlag)

Elektrofusion: Gerät mit Kammer, Spannung anlegen, Stromschlag erzeugen, Zellen fusionieren

Hybrid hat Eigenschaften von beiden Organismen

Art des Hybrids hängt von den Eigenschaften der Eltern ab (symmetrisch, Cybrid, asymmetrisch)

Identifizierung der Fusionsprodukte (homo-/heterokaryotische Fusionen, Cybriden) 

Selektion über unterschiedliche Färbung (etiolierte & nicht etiolierte paaren), Vitalfarbstoffe, Inaktivierung von einem ZK durch Bestrahlung (nur Cybriden am Ende)

-> post- / präzygotische Inkompatibilität

Embryo Rescue Verfahren

Herauspräparieren des Embryos in verschiedenen frühen Entwicklungsstadien

Regeneration über Gewebekultur

je früher das Entwicklungsstadium, desto unwahrscheinlicher sind Probleme des Embryos mit dem Endosperm

-> postzygotische Inkompatibilität

Dekapitierung der Narben

- Signale des Stigmas lassen nur Pollen der gleichen Art auskeimen

- Narbe abschneiden, keine negativen Signale mehr

-> präzygotische Inkompatibilität

a. Transformation von Pflanzen

1. Agrobakterien

2. Particle Bombardement

b. Reportergen & Selektionsmarker

Reportergene => Erkennung transgener Zellen & Pflanzenteile, zB GUS

Selektionsmarker => Differenzierung zwischen transgenen & nicht-transgenen Regeneraten, zB Antibiotika-Selektion

c. Herbizidtoleranz + Strategie

Glyphosat-Toleranz über

1. Überexpression EPSPS (5-Enolpyruvylshikimat-3-P-Synthase)

• Genamplifizierung - multiple Kopien (bis zu 20)
• Konstrukt: konstitutiver Promotor, pflanzeneigenes Gen
• CTP = cp Transit Peptide

2. Mutierte EPSP-Synthase

1. Hybrid im EPSPS-Gen: CTP, N-Terminus der Petunien-EPSPS, C-Terminus des mutierten E.-coli-Gens
2. Hybrid-EPSPS-Gen: CTP, mutiertes EPSPS-Gen - resistent gg Glyphosat, aber niedrieger Km-Wert für PEP => Roundup Ready, dikotyle Kulturpflanzen von Monsanto (Soja, Baumwolle, Raps) & Monokotyle

3. Detoxifizierung durch heterologe Gene

- Glyphosatoxidase (GOX) aus Ochrobactrum anthropi, Stamm LBAA

- + CTP vermittelt sehr gute Toleranz in Raps

- Kombi von CTP & GOX mit Agrobacterium-CP4-EPSPS: erhöhte Toleranz, keine Akkumulation des Herbizids

a. DH-Linien

1. Antherenkultur
2. Mikrosporenkultur
3. Embryokultur

b. Methoden

• Antherenkultur Getreide
  • Kreuzungskorn
  • Spenderpflanze, Stadium 39-49
  • Kältevorbehandlung, 4°C, 8-14 Tage
  • Blüte mit Antheren
  • Antheren rauspräparieren
  • Induktion auf Induktionsmedium
  • Brutschrank, 24-28°C, 3-6 Wochen
  • Embryoide & Calli entstehen
  • Regeneration 
  • Kulturraum, 14 Std. Licht, 22-24°C, 4-8 Wochen
  • haploide / spontan DH-Pflanze, Spross- & Wurzelbildung
  • Colchizinbehandlung der haploiden Pflanzen
  • fertile DH-Pflanze
• Mikrosporenkultur
  • Blütenknospen
  • Mikrosporen aus dem richtigen Stadium entnehmen
  • Flüssigmedium
  • Embryonen
  • Calli, Sprosse (somatische Embryogenese)
  • Bewurzelung
  • Sprossinduktion
  • haploide Pflanze
• Embryokultur bei Getreiden
  • Kreuzungskorn
  • Weizenähre
  • Weizenblüte
  • entfernen der Antheren
  • bestäuben mit Maispollen
  • Injektion einer Hormonlösung
  • Gewinnung des haploiden Embryos
  • Regenerationsmedium
  • haploide Pflanze
  • Colchizin
  • fertile DH-Pflanze

c. Vorteile ggü Inzucht

• Wegfall des langwierigen Zuchtganges
• Befreiung des Genoms von Allelen eines Gens, die im homozygoten Zustand eine letale / subletale Wirkung auf die Entwicklung ausüben => solche Haploide sind nicht lebensfähig
• Auslese auf rezessive Merkmale
• höhere Ausbeute an DH-Nachkommen (rezessiv) als bei spaltenden Nachkommenschaften

d. Colchizin

• Spindelgift
• keine Trennung der Chromosomen