Biotechnologie und Biokatalyse an der Universität Greifswald
Karteikarten und Zusammenfassungen für Biotechnologie und Biokatalyse an der Universität Greifswald
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Geben sie ein Beispiel für eine erfolgreiches Metabolic Engineering an (detailliert).
- L‑Serin aus Corynebacterium glutamicum
- Anwendungen:
- Pharmazeutische Industrie (Infusionslösungen)
- Nahrungsmittel (Proteindrinks)
- Kosmetikindustrie (Feuchtigkeitsspender)
- als Baustein (Tryptophanproduktion)
- Idee: Produktion von L‑Serin aus Glucose durch Corynebacterium glutamicum
- Veränderungen im Stoffwechselweg
- um genügend Vorläufer-Substrate zu haben -> Import der Glucose und Verhinderung des Abbaus von 3‑PG über PEP zu Pyruvat (Deletion der Pyruvat-Kinase) oder anderer Nebenreaktionen die das limitierte Substrat verbrauchen
- Deregulation der 3‑Phosphoglycerat Dehydrogenase (SerA: Schlüsselenzym) durch Verwendung verkürzter Enzymvariante (SerAfbr) -> Verhinderung der feedback-Hemmung durch L‑Serin, aber auch geringfügig weniger Aktivität
- Überexpression der Gene für die L‑Serin‑Biosynthese -> Erhöhung Produktivität der Synthese
- Verringerung der Stoffwechselwege, die L‑Serin über Pyruvat oder Glycin abbauen -> Deletion der L‑Serin Dehydratase + SHMT (Serin hydroyxmethyltransferase)
- deutlicher Anstieg der Serin-Konzentration, jedoch Kombi der beiden wichtig
- L-Serin aus Zelle bekommen um Konzentration in Zelle zu verringern -> zusätzlichen L‑Threonin/L‑Serin Exporter einführen um feedback‑Hemmung noch mehr einzudämmen
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Erläutern Sie die Strategien um die Produktion/Biosynthese einer bestimmten Zielverbindung zu verbessern
- gentechnische Ansätze:
- Genmanipulation -> Einklonierung neuer Enzyme in andere Organismen, Mutationen oder Deletionen …
- Inhibierung oder Drosselung von Schlüsselenzymen konkurrierender Nebenreaktionen
- Abbau störender/toxischer Intermediate -> vor allem bei neuen Produkten
- Verstärkung der Aktivität oder Überexpression von Schlüsselenzymen des gewünschten Stoffwechselweges
- Etablierung alternativer Stoffwechselwege
- Einbau spezifische Enzyme für das gewünschte Substrat
- Verhinderung von Produktdegeneration oder Produkthemmung der gewünschten Stoffwechselwege -> Variationen der verantwortlichen Enzyme mit ähnlicher Aktivität
- Verfahrenstechnische Ansätze:
- in vitro Analyse der Metabolite, Substrate und Produktkonzentrationen (z. durch MS‑Analysen)
- Anpassung und Variation der Kultivierungsbedingungen zur Erhöhung der Ausbeute
- Methoden:
- Metagenomics -> Zugang zu Biodiversität (allgemein „omics“‑Technologien -> Stoffflussanalyse)
- Ultra-Hochdurchsatz DNA‑Sequenzierung
- Protein-Engineering
- Klonierung + Knock out/in
- Gensynthese
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Erklären Sie was zellfreie Proteinbiosynthese ist.
- Proteinbiosynthese findet außerhalb der Zelle (ohne Zellwand und Zellmembran) statt -> müssen also nicht mit Transportsystemen überwunden werden
- Sowohl Translation als auch Transkription finden außerhalb der Zelle statt
- meist genutzt für rekombinante Proteine
- Proteine, AS, Nukleotide, Energieträger und Transkriptions- bzw. Translationsapparat (auch tRNA) müssen vorhanden sein, natürlich auch das gewünschte Gen
- Enzymatische statt chemischer Synthese außerhalb der Zelle
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Vor und Nachteile der zellfreien Proteinbiosynthese.
- Vorteile:
- Zellwand oder -membran muss nicht mehr überwunden werden
- „unnötige“ bzw. störende Einflüsse ganzer Zellen werden ausgeschlossen
- Expression (zell-)toxischer oder markierter Proteine möglich (keine extra Trabsporter weil größer)
- Einbau nicht natürlicher AS möglich
- Expression unlöslicher Proteine möglich?
- einfache Expression kleiner Mengen Proteine -> biochemische Untersuchungen ohne großen Aufwand
- Hohe Reinheit /Expressionsraten (da nur ein Gen bzw. kleine Menge)
- keine Inclusion bodies
- kein Abbau durch Proteasen
- kontinuierliche Systeme möglich
- Verwendung alternativer Cofaktoren möglich?
- Nachteile:
- Hintergrundsynthesereaktionen
- Findet nicht in vivo statt -> keine natürlichen posttranslationalen Modifikationen durch Enzyme in der Zelle (z.B Glykosylierung), keine Regulierung
- komplexere Faltungen der Proteine und Ausbildung von Disulfidbrücken ist schwierig
- keine Produktion in großen Maßstäben möglich
- keine Langzeitsynthese
- teuer
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Geben Sie die Einsatzmöglichkeiten der zellfreien Proteinbiosynthese an.
- Functional genomics
- schnelle + ökonomische Genexpression/Human-Genom-Projekt (Protein chips)
- Protein design
- Gerichtete Evolution (ribosomal display)
- Proteinstruktur (high throughput)
- Rationales Proteindesign (nicht-natürliche AS/ artifizielle Proteine)
- Genregulation + Metabolic engeneering
- Methodisches Werkzeug zur Prozessentwicklung
- Mathematische Modellierung und Simulation der Genexpression (designer genomics)
- Expression von DNA aus nicht-kultivierbaren MOs
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Welche zellfreien Lysate wurden bisher beschrieben?
- Prokaryotische Systeme (E.coli S30-Lysat)
- Eukaryotische Systeme (z.B. Wheat germ, CHO-, Insektenzelllysate) -> hier Weizenkeim beschrieben
- PURE system
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In welchen Bereichen (Produkte) wird Pflanzenbiotechnologie verwendet und warum?
- Erhöhung der Ausbeuten
- gesicherte Erträge (z.B Herbizidresistenzen)
- Resistenzen gegen Gylphosat und Phosphinotricin
- weniger Einsatz von Pflanzenschutzmitteln
- Resistenzen gegen Viren und Pilzen (Weizen, Kartoffeln und Bohnen)
- weniger problematisch bezüglich Umweltbelastung
- Stresstoleranz gegen Dürre, Wasser und Temperatur
- Veränderung des Produktspektrums (z.B. Fettsäuremuster)
- Verbesserte Inhaltsstoffe in Futter und Nahrungspflanzen -> Fettsäuren, Aminosäuren, geringeres Allergiepotential
- Produktion artfremder Inhaltsstoffe (z.B. Wirkstoffe) -> Pharmakologie
- Impfstoffe, Wirkstoffe, therapeutische AK
- Insektizid-Produktion im Bt‑Mais
- Gewünschte Eigenschaften -> Anti Matsch Tomate (länger Haltbarkeit)
- Beispiel Bt‑Mais:
- Einschleusen von Genen des Bakteriums Bacillus thuringiensis
- Produktion unterschiedlicher Toxine (töten Insekten) -> nicht toxisch für den Menschen
- Einsparung von Insektiziden
- mehr Ertrag
- weniger Schimmelpilzbefall kann auch Schmetterlinge umbringen
- sammelt sich im Boden -> Auswirkungen noch nicht erforscht
- Erste Resistenzen beobachtete -> auch schon Mutationen um diese zu überwinden
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Erklären Sie die Wirkungsweise der Resistenzvon genetisch veränderten Pflanzen gegenüber Herbiziden/Pestiziden.
- Glyphosat: Einführung bakterielle EPSP (5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase), da sonst EPSP der Pflanze gehemmt werden würde -> würde zu Hemmung von AS‑Bildung führen (Tryp, Tyr, Phe)
- Phosphinotricin:
- Nicht-proteinogene AS -> L‑Enantiomer inhibiert Glutamin-Synthase in Pflanzen und Bakterien
- Pflanzen resistent durch Einklonierung einer PTC‑Acetyltransferase aus Streptomyces hygroscopus (Tabak, Kartoffeln, Raps u.a.)
- Allgemein: Überexpression, Veränderung, Inaktivierung von Genen oder Einführung fremdes Gen damit bestimmte Eigenschaft verändert wird
- Veränderung der Proteine (Spaltung ... )
- Toxinabbau oder -abtransport
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Wie kannn Fremd-DNA in Pflanzen eingeschleust werden?
- Infektion einer Pflanze durch Agrobacterium tumefaciens (funktioniert nur bei zweikeimblättrigen Pflanzen)
- A.t. heftet sich an verwundete Pflanzenzelle
- Pflanzenzelle sendet chemotaktische Signale und aktiviert Virulenzregion
- Virulenzregion des Ti‑Plasmids aktiviert T‑Region
- T‑Region wird als lineare einzelsträngige DNA in Pflanzenchromosom integriert
- Particel gun/ gene gun
- Elektroporation
- Mikroinjektion
- Floral dip (Eintauchen von Pflanzen in A.t Suspension bis Blüten vollständig benetzt + Inkubation)
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Erläutern Sie den Begriff "gerichtete Evolution".
- Evolution im Reagenzglas zur Optimierung/ Modifikation von Proteinen
- zwei Hauptschritte:
- zufällige Mutagenese von Genen, die Enzyme codieren
- Identifikation der gewünschten biokatalytischen Varianten durch Screening oder Selektion
- wenige Informationen über das Protein nötig (z.B. nichts über Raumstruktur oder Zusammenhänge zwischen Struktur und Mechanismus
- schnelle Erzeugung zahlreicher Mutationen
- Nutzen der Bibliothek für viele Fragestellungen (z.B. pH-Stabilität)
- Voraussetzungen:
- Funktionelle Expression in geeignetem Wirt (am besten mikrobiell)
- effektive Mutationsstrategie
- schnelles und zuverlässiges Assaysytem (High Throughput-Screening) -> schnelle Identifikation Enzym-Variante
- oftmals werden mehrere Durchläufe mit Selektion benötigt (SELEX-Prinzip mit Kreislauf)
- Methoden rekombinierend und nicht-rekombinierend
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Erklären Sie den Unterschied zwischen rekombinierenden und nicht-rekombinierenden Methoden (sexuelle vs. asexuelle Methoden).
- Rekombinierend: DNA-(family)-shuffling, STEP, random priming. ITCHY
- Verwendung von Wildtyp-Gen und verwandten Gene -> Vermischung (Rekombination) dieser
- nicht-rekombinierend: error-prone PCR, Sättigungs-Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, Mutations-Stämme
- nur Verwendung Wildtyp Gen -> Einführung von Mutationen
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Erläutern sie den Begriff „Metabolic Engineering“. Welches sind die beiden wichtigsten methodischen Ansätzen?
- Regulation bzw. Kontrolle des Metabolismus in Zellen um die Konzentration bestimmter Metabolite zu erhöhen
- Optimierung der Ausbeute und Produktivität
- Nebenreaktionen verhindern, alternative Stoffwechselwege entwickeln
- Verständnis der Organismen, Stoffwechselwege und ihrer Dynamiken von Nöten um Stellen die verändert werden sollen zu identifizieren -> Verstärkung/Drosslung/Einfügen von Enzymen
- Zusammenstellung von Reaktionen und deren Abhängigkeit in Netzwerken/Datenbanken
- Ansätze:
- Gentechnischer Ansatz: vorhandene Enzyme anpassen durch biochemische Untersuchungen + Optimierung über rationales/evolutionäres Design
- Verfahrenstechnischer Ansatz: Anpassen von Bedingungen oder Verfahren -> Änderung der metabolischen Funktion möglich (Temperatur, pH, Rührgeschwindigkeit…)
- synthetisch (bioinformatischer) Ansatz -> Design der Stoffwechselwege anhand von Modellen und Datenbanken -> komplette synthetische Herstellung der Enzyme -> sehr aufwendig
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