Biotechnologie und Biokatalyse an der Universität Greifswald

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Geben sie ein Beispiel für eine erfolgreiches Metabolic Engineering an (detailliert).

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Erläutern Sie die Strategien um die Produktion/Biosynthese einer bestimmten Zielverbindung zu verbessern

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Vor und Nachteile der zellfreien Proteinbiosynthese.

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Geben Sie die Einsatzmöglichkeiten der zellfreien Proteinbiosynthese an.

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Welche zellfreien Lysate wurden bisher beschrieben? 

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In welchen Bereichen (Produkte) wird Pflanzenbiotechnologie verwendet und warum?

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Erklären Sie die Wirkungsweise der Resistenzvon genetisch veränderten Pflanzen gegenüber Herbiziden/Pestiziden.

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Wie kannn Fremd-DNA in Pflanzen eingeschleust werden?

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Erläutern Sie den Begriff "gerichtete Evolution".

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Erklären Sie den Unterschied zwischen rekombinierenden und nicht-rekombinierenden Methoden (sexuelle vs. asexuelle Methoden).

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Biotechnologie und Biokatalyse

Geben sie ein Beispiel für eine erfolgreiches Metabolic Engineering an (detailliert).

  • L‑Serin aus Corynebacterium glutamicum
  • Anwendungen: 
    1. Pharmazeutische Industrie (Infusionslösungen)
    2. Nahrungsmittel (Proteindrinks)
    3. Kosmetikindustrie (Feuchtigkeitsspender)
    4. als Baustein (Tryptophanproduktion)
  • Idee: Produktion von L‑Serin aus Glucose durch Corynebacterium glutamicum
  • Veränderungen im Stoffwechselweg
    1. um genügend Vorläufer-Substrate zu haben -> Import der Glucose und Verhinderung des Abbaus von 3‑PG über PEP zu Pyruvat (Deletion der Pyruvat-Kinase) oder anderer Nebenreaktionen die das limitierte Substrat verbrauchen
    2. Deregulation der 3‑Phosphoglycerat Dehydrogenase (SerA: Schlüsselenzym) durch Verwendung verkürzter Enzymvariante (SerAfbr) -> Verhinderung der feedback-Hemmung durch L‑Serin, aber auch geringfügig weniger Aktivität
    3. Überexpression der Gene für die L‑Serin‑Biosynthese -> Erhöhung Produktivität der Synthese
    4. Verringerung der Stoffwechselwege, die L‑Serin über Pyruvat oder Glycin abbauen -> Deletion der L‑Serin Dehydratase + SHMT (Serin hydroyxmethyltransferase) 
      • deutlicher Anstieg der Serin-Konzentration, jedoch Kombi der beiden wichtig
    5. L-Serin aus Zelle bekommen um Konzentration in Zelle zu verringern -> zusätzlichen L‑Threonin/L‑Serin Exporter einführen um feedback‑Hemmung noch mehr einzudämmen

Biotechnologie und Biokatalyse

Erläutern Sie die Strategien um die Produktion/Biosynthese einer bestimmten Zielverbindung zu verbessern

  • gentechnische Ansätze:
    1. Genmanipulation -> Einklonierung neuer Enzyme in andere Organismen, Mutationen oder Deletionen …
    2. Inhibierung oder Drosselung von Schlüsselenzymen konkurrierender Nebenreaktionen 
    3. Abbau störender/toxischer Intermediate -> vor allem bei neuen Produkten 
    4. Verstärkung der Aktivität oder Überexpression von Schlüsselenzymen des gewünschten Stoffwechselweges 
    5. Etablierung alternativer Stoffwechselwege
    6. Einbau spezifische Enzyme für das gewünschte Substrat
    7. Verhinderung von Produktdegeneration oder Produkthemmung der gewünschten Stoffwechselwege -> Variationen der verantwortlichen Enzyme mit ähnlicher Aktivität
  • Verfahrenstechnische Ansätze:
    1. in vitro Analyse der Metabolite, Substrate und Produktkonzentrationen (z. durch MS‑Analysen)
    2. Anpassung und Variation der Kultivierungsbedingungen zur Erhöhung der Ausbeute
  • Methoden: 
    1. Metagenomics -> Zugang zu Biodiversität (allgemein „omics“‑Technologien -> Stoffflussanalyse)
    2. Ultra-Hochdurchsatz DNA‑Sequenzierung 
    3. Protein-Engineering
    4. Klonierung + Knock out/in
    5. Gensynthese

Biotechnologie und Biokatalyse

Erklären Sie was zellfreie Proteinbiosynthese ist.

  • Proteinbiosynthese findet außerhalb der Zelle (ohne Zellwand und Zellmembran) statt -> müssen also nicht mit Transportsystemen überwunden werden
  • Sowohl Translation als auch Transkription finden außerhalb der Zelle statt
  • meist genutzt für rekombinante Proteine 
  • Proteine, AS, Nukleotide, Energieträger und Transkriptions- bzw. Translationsapparat (auch tRNA) müssen vorhanden sein, natürlich auch das gewünschte Gen
  • Enzymatische statt chemischer Synthese außerhalb der Zelle

Biotechnologie und Biokatalyse

Vor und Nachteile der zellfreien Proteinbiosynthese.

  • Vorteile:
    1. Zellwand oder -membran muss nicht mehr überwunden werden
    2. „unnötige“ bzw. störende Einflüsse ganzer Zellen werden ausgeschlossen
    3. Expression (zell-)toxischer oder markierter Proteine möglich (keine extra Trabsporter weil größer)
    4. Einbau nicht natürlicher AS möglich
    5. Expression unlöslicher Proteine möglich?
    6. einfache Expression kleiner Mengen Proteine -> biochemische Untersuchungen ohne großen Aufwand
    7. Hohe Reinheit /Expressionsraten (da nur ein Gen bzw. kleine Menge)
    8. keine Inclusion bodies 
    9. kein Abbau durch Proteasen
    10. kontinuierliche Systeme möglich
    11. Verwendung alternativer Cofaktoren möglich?
  • Nachteile:
    1. Hintergrundsynthesereaktionen
    2. Findet nicht in vivo statt -> keine natürlichen posttranslationalen Modifikationen durch Enzyme in der Zelle (z.B Glykosylierung), keine Regulierung 
    3. komplexere Faltungen der Proteine und Ausbildung von Disulfidbrücken ist schwierig
    4. keine Produktion in großen Maßstäben möglich          
    5. keine Langzeitsynthese
    6. teuer

Biotechnologie und Biokatalyse

Geben Sie die Einsatzmöglichkeiten der zellfreien Proteinbiosynthese an.

  • Functional genomics
    1. schnelle + ökonomische Genexpression/Human-Genom-Projekt (Protein chips)
  • Protein design
    1. Gerichtete Evolution (ribosomal display)
    2. Proteinstruktur (high throughput)
    3. Rationales Proteindesign (nicht-natürliche AS/ artifizielle Proteine)
  • Genregulation + Metabolic engeneering
    1. Methodisches Werkzeug zur Prozessentwicklung
    2. Mathematische Modellierung und Simulation der Genexpression (designer genomics)
  • Expression von DNA aus nicht-kultivierbaren MOs

Biotechnologie und Biokatalyse

Welche zellfreien Lysate wurden bisher beschrieben? 

  • Prokaryotische Systeme (E.coli S30-Lysat)
  • Eukaryotische Systeme (z.B. Wheat germ, CHO-, Insektenzelllysate) -> hier Weizenkeim beschrieben
  • PURE system

Biotechnologie und Biokatalyse

In welchen Bereichen (Produkte) wird Pflanzenbiotechnologie verwendet und warum?

  • Erhöhung der Ausbeuten
  • gesicherte Erträge (z.B Herbizidresistenzen)
    1. Resistenzen gegen Gylphosat und Phosphinotricin
  • weniger Einsatz von Pflanzenschutzmitteln
    1. Resistenzen gegen Viren und Pilzen (Weizen, Kartoffeln und Bohnen)
  • weniger problematisch bezüglich Umweltbelastung
    1. Stresstoleranz gegen Dürre, Wasser und Temperatur
  • Veränderung des Produktspektrums (z.B. Fettsäuremuster)
    1. Verbesserte Inhaltsstoffe in Futter und Nahrungspflanzen -> Fettsäuren, Aminosäuren, geringeres Allergiepotential
  • Produktion artfremder Inhaltsstoffe (z.B. Wirkstoffe) -> Pharmakologie
    1. Impfstoffe, Wirkstoffe, therapeutische AK
    2. Insektizid-Produktion im Bt‑Mais
  • Gewünschte Eigenschaften -> Anti Matsch Tomate (länger Haltbarkeit)
  • Beispiel Bt‑Mais:
    1. Einschleusen von Genen des Bakteriums Bacillus thuringiensis
    2. Produktion unterschiedlicher Toxine (töten Insekten) -> nicht toxisch für den Menschen
    3. Einsparung von Insektiziden
    4. mehr Ertrag
    5. weniger Schimmelpilzbefall kann auch Schmetterlinge umbringen 
    6. sammelt sich im Boden -> Auswirkungen noch nicht erforscht
    7. Erste Resistenzen beobachtete -> auch schon Mutationen um diese zu überwinden

Biotechnologie und Biokatalyse

Erklären Sie die Wirkungsweise der Resistenzvon genetisch veränderten Pflanzen gegenüber Herbiziden/Pestiziden.

  • Glyphosat: Einführung bakterielle EPSP (5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase), da sonst EPSP der Pflanze gehemmt werden würde -> würde zu Hemmung von AS‑Bildung führen (Tryp, Tyr, Phe)
  • Phosphinotricin: 
    1. Nicht-proteinogene AS -> L‑Enantiomer inhibiert Glutamin-Synthase in Pflanzen und Bakterien
    2. Pflanzen resistent durch Einklonierung einer PTC‑Acetyltransferase aus Streptomyces hygroscopus (Tabak, Kartoffeln, Raps u.a.)
  • Allgemein: Überexpression, Veränderung, Inaktivierung von Genen oder Einführung fremdes Gen damit bestimmte Eigenschaft verändert wird 
    1. Veränderung der Proteine (Spaltung ... )
    2. Toxinabbau oder -abtransport

Biotechnologie und Biokatalyse

Wie kannn Fremd-DNA in Pflanzen eingeschleust werden?

  • Infektion einer Pflanze durch Agrobacterium tumefaciens (funktioniert nur bei zweikeimblättrigen Pflanzen)
    1. A.t. heftet sich an verwundete Pflanzenzelle 
    2. Pflanzenzelle sendet chemotaktische Signale und aktiviert Virulenzregion
    3. Virulenzregion des Ti‑Plasmids aktiviert T‑Region
    4. T‑Region wird als lineare einzelsträngige DNA in Pflanzenchromosom integriert
  • Particel gun/ gene gun
  • Elektroporation
  • Mikroinjektion
  • Floral dip (Eintauchen von Pflanzen in A.t Suspension bis Blüten vollständig benetzt + Inkubation)

Biotechnologie und Biokatalyse

Erläutern Sie den Begriff "gerichtete Evolution".

  • Evolution im Reagenzglas zur Optimierung/ Modifikation von Proteinen
  • zwei Hauptschritte: 
    1. zufällige Mutagenese von Genen, die Enzyme codieren
    2. Identifikation der gewünschten biokatalytischen Varianten durch Screening oder Selektion
  • wenige Informationen über das Protein nötig (z.B. nichts über Raumstruktur oder Zusammenhänge zwischen Struktur und Mechanismus
  • schnelle Erzeugung zahlreicher Mutationen
  • Nutzen der Bibliothek für viele Fragestellungen (z.B. pH-Stabilität)
  • Voraussetzungen:
    1. Funktionelle Expression in geeignetem Wirt (am besten mikrobiell) 
    2. effektive Mutationsstrategie 
    3. schnelles und zuverlässiges Assaysytem (High Throughput-Screening) -> schnelle Identifikation Enzym-Variante
  • oftmals werden mehrere Durchläufe mit Selektion benötigt (SELEX-Prinzip mit Kreislauf)
  • Methoden rekombinierend und nicht-rekombinierend

Biotechnologie und Biokatalyse

Erklären Sie den Unterschied zwischen rekombinierenden und nicht-rekombinierenden Methoden (sexuelle vs. asexuelle Methoden).

  • Rekombinierend: DNA-(family)-shuffling, STEP, random priming. ITCHY
    1. Verwendung von Wildtyp-Gen und verwandten Gene -> Vermischung (Rekombination) dieser
  • nicht-rekombinierend: error-prone PCR, Sättigungs-Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, Mutations-Stämme
    1. nur Verwendung Wildtyp Gen -> Einführung von Mutationen

Biotechnologie und Biokatalyse

Erläutern sie den Begriff „Metabolic Engineering“. Welches sind die beiden wichtigsten methodischen Ansätzen?

  • Regulation bzw. Kontrolle des Metabolismus in Zellen um die Konzentration bestimmter Metabolite zu erhöhen
    1. Optimierung der Ausbeute und Produktivität 
    2. Nebenreaktionen verhindern, alternative Stoffwechselwege entwickeln
    3. Verständnis der Organismen, Stoffwechselwege und ihrer Dynamiken von Nöten um Stellen die verändert werden sollen zu identifizieren  -> Verstärkung/Drosslung/Einfügen von Enzymen
  • Zusammenstellung von Reaktionen und deren Abhängigkeit in Netzwerken/Datenbanken
  • Ansätze:
    1. Gentechnischer Ansatz: vorhandene Enzyme anpassen durch biochemische Untersuchungen + Optimierung über rationales/evolutionäres Design
    2. Verfahrenstechnischer Ansatz: Anpassen von Bedingungen oder Verfahren -> Änderung der metabolischen Funktion möglich (Temperatur, pH, Rührgeschwindigkeit…)
    3. synthetisch (bioinformatischer) Ansatz -> Design der Stoffwechselwege anhand von Modellen und Datenbanken -> komplette synthetische Herstellung der Enzyme -> sehr aufwendig

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