Genetik an der Universität Graz

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Was ist Epigenetik? 

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Was ist Genetik?

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DNA als Erbmaterial 

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Initiation der Replikation

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Replikationsvorgang

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Nenne die zwei gängigsten Zentrifugalmethoden! 

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Erkläre folgende Begriffe: Wildtypallel, Mutation, Nullallel, Letalfaktor

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Was sind "Denautierung" und "Renautierung"? 

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Was wird bei der DNA-Hybridisierung ermittelt?

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Termination der Replikation

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Was untersuchte Gregor Mendel?

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Genetik

Was ist Epigenetik? 

--> Genetik = Beschäftigt sich mit DNA an sich + Allelen

--> Epigenetik (wörtl.: zusätzlich zur Genetik)= Abschreiben d. DNA, Regelung der Acetyliereung bzw. der Methylierung der DNA

  •  Dichter Histonkomplex erschwert das Abschreiben d. DNA
    => "Silencing"
  • Die DNA muss durch Acetylierung gelockert werden, damit sie replizierbar wird. Dazu werden Essigsäurereste an die basischen Aminosäuren angehängt.
  • Die DNA-Abschnitte (verpackt in Histonen), die nicht Abgeschrieben werden, werden Methyliert und somit das "Silencing" fixiert. Ebenso wirkt das Methylieren der Base Cytidin in "CG-Paaren". 

--> Epigenetische Fixierung = Bei Replikation werden die Acetylierungs- und Methylierungszustände weitergegeben/"weitervererbt".

--> In embryonalen Stammzellen, die zu Organen werden, kommt es zum Silencing, um nichtbenötigte Gene auszuschalten. (Bsp.: Nervenzelle, die keine Gallensäure braucht) 

Genetik

Was ist Genetik?

= Wissenschaft der Vererbung

  • Klassische Genetik: Beobachtung der Grundelemente (Phänotyp) ohne Hintergrundwissen - Mendelsche Regeln
  • Molekulare Genetik: untersucht die molekularen Vorgänge mit biochemischen Methoden
  • evolutionäre Populationsgenetik: untersucht Vererbung in Organismengruppen (Herden, Familien)

Genetik

Anfänge der Genetik

  • erste Beobachtungen bei Zuchtpflanzen und Tieren, die aus Wildformen herausgezüchtet wurden
    • dickstes Vieh, größte Frucht zur Weiterzucht
  • Beispiele: Mais und Banane "überzüchtet" und ohne den Menschen nicht mehr überlebensfähig; Karotte: Zuchterfolg

Genetik

DNA als Erbmaterial 

--> DNA wurde als Träger der Erbinformation identifiziert:

  • immer gleiche Menge an Adenin + Thymin bzw. an Guanin + Cytosin
    • = Erster Hinweis auf die Paarung der Basen
  • James Watson und Francis Crick entwickelten aufgrund von Untersuchungen von Rosalind Franklinein Struckturmodell von DNA:
    • rechtsgew. Doppelstrang, Einzelstränge aniparallel
    • Adenin + Thymin und Guanin + Cytosin (="Watson-Crick-Paarung") --> jeweils komplementäre Paare
    • A+T (2 H2-Brücken), G+C (3 H2-Brücken)
    • Eine Umdrehung enthält 10 Basenpaare, DNA-Form ="B-Form" (A+Z-Formen auch vorhanden, aber sehr selten!)


Genetik

Initiation der Replikation

--> Öffnung der Doppelhelix am Origin (Replikationsursprung)

  • Bei E.coli nur eine Origin (oriC) auf Genom
  • Helikase (DnaB) trennt die Stränge -> pro Basenpaar 2 ATP verbraucht, die zu AMP, also 4 Energie-Einheiten abgebaut werden
  • Auseinanderhalten d. Stränge durch das "Single-strand binding protein"

--> Matrizenstränge (template) sind die Vorlage für die folgende Replikation

Genetik

Replikationsvorgang

-> Verlängerung nur an bereits vorhandene Stränge durch Primer.

  • Primer: RNA-Stück (ca. 4-13 Nukleotide), gebildet durch eine Primase (RNA-Polymerase), verlängert durch die DNA-Polymerase III (=DNA abhängige Polymerase)

--> Primosom = Gesamtkomplex, synthetisiert Primer, enthält die Primase und auch die Helikase DnaB

--> DNA- und RNA-Polymerasen arbeiten in 5'-3' Richtung! Neue Nukleotide werden an das 3'-OH des letzten Zuckers angehängt

  • RNA = stabiler als DNA

--> Ausgehend vom Origin kann nur einer der Stränge kontinuierlich synthetisiert werden = Leitstrang (leading strand)

--> Der Folgestrang (lagging strand) muss "verkehrt herum" gebildet werden (= semi-kontinuierlich) 

  • durch kurze Stücke in richtiger Richtung (Okazaki-Fragmente)
    • Bei E.coli etwa 1000 Nucleotide lang
    • Bei Eukaryoten 100-200 Nucleotide lang
  • Jedes Fragment benötigt eigenen Primer, der von der DNA-Polymerase I mit ihrer 5'-3' Exonukleaseaktivität abgebaut und durch die passenden Nukleotide ersetzt wird.
  • Schließlich werden die Fragmente durch die DNA-Ligase verknüpft 
    • ACHTUNG!Auch beim Leading strand sind am Schluss (zum Abbau des Primers am Anfang) DNA-Polymerase I und DNA-Ligase notwendig! 



Genetik

Nenne die zwei gängigsten Zentrifugalmethoden! 

Zentrifugation = Erzeugung von Zentrifugalkräften durch schnelles Drehen (keine "Kraft" an sich sondern "Trägheit"!)
--> um ein Vielfaches größer als Erdanziehungskraft

  • Teilchen in Zentrifugationsgefäß werden um Vielfaches schneller
    --> Sedimentation = Absetzvorgang

--> Einheit für die Sedimentationsgeschwindigkeit ist das Svedberg (S):

  • Ribosomen z.B. haben Untereinheiten von 50S + 30S (prokaryotisch) 
  • Svedbergeinheiten sind NICHT additiv! (bakterielle Ribosomen ing. 70S) 
  • differentielle Sedimentation: Konfigurierung der Drehzahl und Zentrifugationszeit auf das Trennen von z.B. Zellbestandteile:
    •  Vorgegossene Dichtegradienten aus Saccharose (50% unten, 20% in der Mitte, keine oben) verbessern Trennvorgang
    • = Endpunktverfahren!! -> nach zu langem Zentrifugieren landen auch kleinere Partikel auf dem Boden
  • Dichtegradienten-Gleichgewichtszentrifugation: Trennung nach (Schwimm-) Dichte -> Masse pro Volumen
    --> Z.B.: DNA von RNA oder GC-reiche DNA von AT-reicher 
    • Ceasiumgradientenzentrifugation: CsCl-Lösung (sehr schwaches Salz) wird sehr schnell zentrifugiert (=Ultrazentrifugation: über 100.000 fache der Schwerkraft) 
    • Dabei entsteht Dichtegradient: DNA- und RNA-Dichten liegen im Bereich d. Gradienten -> die Moleküle sammeln sich zu Banden, die dort schweben, wo die Salzdichte ihrer Schwimmdichte entsprechen.
    • => Gleichgewichtsverfahren: längere Zentrifugationszeiten ändern das Ergebnis NICHT. 

Genetik

Erkläre folgende Begriffe: Wildtypallel, Mutation, Nullallel, Letalfaktor

  • Wildtypallel = am häufigsten in der Natur vorkommende Allel meist mit (+) oder mit Großbuchstaben (A) gekennzeichnet (Mutantenallele mit Kleinbuchstaben (a))
  • Mutation = Veränderung des Gens oder Genfehler kann zur Abschwächung (hypomorphes Allel) oder zur Steigerung über Wildtypniveau (hypermorphes Allel) der Funktion führen
    • neomorphes Allel = erlangt durch Mutation komplett neue Eigenschaften
  • Nullallel = amorphes Allel, völliger Funktionsverlust
  • Letalfaktor = Allel, das im homozygoten Zustand (reinerbig) zum Tod führt, bei lebenswichtigen Genen ist das Nullallel ein Letalfaktor
    • = rezessives Allel: bei heterozygoten (mischerbigen) Organismus KEIN Todesfaktor

--> Bsp: WT-Gen: codiert für Farbe produzierendes Enzym (z.B.: Blütenfarbe)

  • Nullallel = weiß
  • hypomorphes Allel = rosa
  • hypermorphes Allel = tiefrot
  • neomorphes (sehr selten) = blau, giftig


Genetik

Was sind "Denautierung" und "Renautierung"? 

--> Denautierung der DNA-Helix = "Aufschmelzen" d. DNA unter Lösung der Wasserstoffbrücken 

  • Stränge trennen sich
  • größere UV-Absorbtion -> bessere Messbarkeit
  • GC-reiche DNA hat höheren Schmelzpunkt als AT-reiche

--> Renautierung der DNA-Helix: "Abkühlen" nach Denautierung

  • passende Strangpaare finden sich wieder -> bilden Doppelstrang
  • "Heteroduplex" = Fehler bei Paarfindung, Schmelzpunkt liegt tiefer als bei passenden Strängen

--> hochrepetitive DNA: große Bereiche im Genom haben immer wieder dieselbe Sequenz 

  • kurze - einige Hundert Basenpaare kommen oft tausend Mal vor
    • Renautieren schneller (finden schneller passende Partnerstränge)
  • "Unique sequences": kommen nur einmal oder nicht vermehrt hintereinander vor
    • Renautiertung dauert länger
  • Geschwindigkeit der Renautierung lässt erschließen, ob DNA-Sequenz oft wiederholt vorkommt (und somit weniger Information enthält) oder nicht.



Genetik

Was wird bei der DNA-Hybridisierung ermittelt?

--> DNA-Hybridisierung: Ermittlung der Ähnlichkeit verschiedener Gene (bzw. der Sequenzähnlichkeit)

  • Identifikation von DNA im "Southern-Blot": makierte Sonden-DNA (z.B. radioaktiv) aus DNA-Mischung findet passenden Partner
    • Doppelstrangbildung schon bei hoher Temperatur
      -> große Sequenzähnlichkeit (Heteroduplex mit wenig Fehlpaarungen) 
    • Doppelstrangbildung erst bei niedriger Temperatur
      -> Sequenzen nicht sehr ähnlich

--> = FISH??

Genetik

Termination der Replikation

--> Replikation endet, wenn sich beide Replikationsgabeln "in der Mitte" des Chromosomenkreises treffen.

  • Gene beider Chromosomenhälften sind in Replikationsrichtung orientiert und werden auch in diese Richtung transkribiert 
  • Sollte eine Polymerase verzögert sein (z.B. durch Reperaturen), liest die andere nicht einfach weiter, sondern stoppt an spezieller Terminationssequenz kurz hinter der Chromosomenhälfte
    • Replikationskomplex und Transkriptionskomplex sollten nicht zusammenstoßen! 

Genetik

Was untersuchte Gregor Mendel?

--> Gregor Mendel: "Versuche über Pflanzenhybride" 

  • Kreuzungsexperimente meist an Erbsen
  • Erste biologische Forschung mithilfe von Wahrscheinlichkeitsrechnung (Statistik) 
  • Untersuchung abgrenzbare Merkmale (Allele
  • Reziproke Kreuzungen: zwei Pflanzen mit versch. Merkmalen (beide Pflanzen als m. und w. Partner)
    • nur bei einhäusigen (monözischen) Pflanzen möglich!

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