Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK an der Universität für Bodenkultur Wien

a.) sequenzspezifisch: basierend auf FRET

-Hydrolisierungsproben (Taqman)

-Hybridisierungsproben (molecular beacon, LUX primers)

ein Mechanismus, bei dem Energie zw 2 lichtsensitiven Chromophoren transferiert wird. Geamte freigesetzte Anregungsenergie des Reporters wird vom Quencher gefangen. Quencher wird ducrh zb Taq-Polymerase entfernt, Reporter freigegeben

Hybridisierungsproben (DNA Fragment markiert) transferieren die Energie zu 2. Chromophor, welches langwelligeres Licht freilässt als die anregende Wellenlänge und die Emission   von der ersten Probe

b.) nicht sequenzspezifisch

Verwendung von Floureszenzfarbstoffen, die sich in die DNA Doppelhelix einlagern zb. SYBR-Green 

Vorteil: Ziel-Spezifikation, präzise&sensitiv

Nachteil: teuer

Elektrophorese“ = Migration von gel. Molekülen in einem def. elektrischen Feld

Wenn Probe nicht ganz rein ist → auch Verunreinigungen → zB kann auch andere

Proteine anzeigen (RNA etc) welche dann, je nach Größe, weiter oder weniger weiter wandern ist abhängig von der Gel-Konzentration und der Feldstärke. DNA ist eig. Immer größer als RNA (bzw andere Proteine) → Banden sind weiter oben am Gel zu sehen (mehr bp) Nach einer PCR erkennt man auch oft eine unscharfe Primer Wolke

1. SDS-Page-gel

2. Einheit die elektr. Strom generiert

3. Elektrophorese Equipment

4. El. Puffer

5. Protein Transfer Einheit

6. Übertragungspuffer

7. Waschpuffer

8. Blocking Lösung

9. Primary antibody

10. Secondary Antibody (nur benötigt, wenn primary antibody nicht konjugiert ist)

11. Substrat für Enzym zB HRP-Substrat

12. X-Ray Film + Fixierer

13. Und Entwicklungslösung oder „imaging system“

Annahme: Probe gleicher Menge an Targetgen und Referenzgen, Effizienz des einen Gens=100%, anderes=90% bei 25 Zyklen für die Quantifizierung -> berechneter Fehler bei 3,6 folds oder 360%.

wichtig!: miteinbeziehung der Effizienz des Referenzgens & Targetgens. Mit Hilfe von Standardkurven für die Target- und Referenzgensequenzen oder das LineRegPCT-Programm

vorgefärbten Proteinmarkern -> Bestätigung des Transfers auf Membran anschließende Bestimmung der Größe des Zielproteins. 

Proteine, die an Nitrocellulose und PVDF-Membranen gebunden, mit Ponceau S gefärbt werden, bindet an positiv geladenen AS Gruppen der Proteine. Färbung zur Überwachung einer gleichen Beladung und den Transfer der Proteine zu. Die Färbung leicht durch Inkubation in Wasser od. NaOH entfernt werden. Anschließend immunologische Detektion.

2^n-2; n= Anzahl der Zyklen

a.) 2^20-2 = 2,6 x 10^5 Kopien

b.)10* 2^20-2 = 2,6 x 10^6 Kopien

Parametern die die Effektivität der PCR beeinflussen:

- Beschränkung der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (zb Halbwertszeit der Taq-Polymerase bei 95°C = 40)

- Beschränkung der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von DNA-Oligonukleotiden (Primern) an entspr. Matrizenstränge

Verschiedene Parameter die die Effizienz der qPCR beeinflussen können (Anzahl Zyklen bevor Plateau-Phase eintritt):

je weniger Zyklen notwendig sind, desto mehr Zielmolekül ist in der Probe

Amplifikationseffizienz nimmt durch die Anreicherung des Reaktionsproduktes Pyrophosphat kontinuierlich ab. Wenn Plateau erreicht keine Amplifikation mehr.

BLAST = Basic Local Alignment Search Tool, basiert auf FASTA Algorithmus.

1) blastn: DNA/DNA

2) blastx: Protein/Protein

3) blastp: DNA/ Protein

4) tblastn: Protein/DNA

BLAST oder FASTA

Datenbank: Genbank, EMBL-Bank, DDBJ

➔ Nitrocellulose Membran:

erzeugen ausgezeichnete Signal-Rausch-Ergebnisse. Proteine binden hauptsächlich durch nichtkovalente, hydrophobe WW

Vorteil: ist das geringe Hintergrundrauschen

Nachteil: zerbrechlich daher nur einmal verwendet werden. Stabilisierung durch 

Einbringen eines Polyestermaterials in die Membran

➔ Nylonmembranen:

Transfer von NS wie DNA (Southern Blot) oder RNA (Northern Blot) von Gelen auf Membranen. Binden Proteine durch elektrostatische WW

Nachteil: Schwierigkeit alle unspezifischen Bindungsstellen auf Membran zu blockieren → höheres Hintergrundsignal.

➔ PVDF-Membrane:

werden zum Immunblotting von Proteinen. Binden durch stark hydrophobe und Dipol-WW. Nachteil: größere Bindungsspezifität, die das Signal verstärken-> höheren Hintergrund 

Vorteil: mechanisch stark, haltbar, lösungsmittelbeständiger -> mehrfaches Beproben hydrophob -> Membran vorbenetzen

a) 3 von 3 Stellen methyliert → 1 Fragment

b) 1 von 3 Stellen methyliert → 3 Fragmente

c) 0 von 3 Stellen methyliert → 4 Fragmente

???

Primergröße: Bindungsspezifität (je kürzer, desto unspezifischer), Wahrscheinlichkeit e. Sekundärstruktur zu bilden (je länger, desto wahrscheinlicher), Kosten (je länger, desto teurer)

• Gewünschte Größe: 16-30 bp

• GC-Anteil: Der GC-Anteil des Primers sollte 40-60% betragen.

• GC-Klammer: Nicht mehr als 3 G/C sollten in den letzten 5 Basen.

• Wiederholungen: nicht mehr als 4 Dinukleotide; zb.: ATATATAT

• Runs:

Primer mit langen Runs einer einzelnen Base sollten vermieden werden 

Max. Anzahl an Runs: 4 bp; zb AGCGGGGGATGGGG

• B, BESSER GEEIGNET