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Lernmaterialien für Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK an der Universität für Bodenkultur Wien

Greife auf kostenlose Karteikarten, Zusammenfassungen, Übungsaufgaben und Altklausuren für deinen Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK Kurs an der Universität für Bodenkultur Wien zu.

TESTE DEIN WISSEN

Bisulfitsequenzierung: Was wird verändert , wozu genutzt? + Mechanismus, welches Nukleotid wird modifiziert?

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TESTE DEIN WISSEN

-Die Behandlung von genom. DNA mit Natriumbisulfit wandelt C in U um, während 5'-Methyl-Cytosin unbeeinflusst bleibt

-Diese diff. Umwandlung wird mit PCR nachgewiesen

-Feststellung ob ein Cytosin in der sequenzierten Region methyliert wurde oder nicht

-Methylierte Cytosinreste sind resistent gegüber d. Bisulfitumwandlung und können als Anzeige für den Status der DNA-Methylierung dienen

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TESTE DEIN WISSEN

Wie viel Produkt hat man nach 20 PCR-Runden wenn man mit

a. einem Molekül

b. 10 Molekülen beginnt.

Warum sind diese Werte nicht in der Praxis anzutreffen?

Wieso sinkt Effizienz bei höherer cycle number?

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

2^n-2; n= Anzahl der Zyklen

a.) 2^20-2 = 2,6 x 10^5 Kopien

b.)10* 2^20-2 = 2,6 x 10^6 Kopien

 

Parametern die die Effektivität der PCR beeinflussen:

- Beschränkung der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (zb Halbwertszeit der Taq-Polymerase bei 95°C = 40)

- Beschränkung der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von DNA-Oligonukleotiden (Primern) an entspr. Matrizenstränge

 

Verschiedene Parameter die die Effizienz der qPCR beeinflussen können (Anzahl Zyklen bevor Plateau-Phase eintritt):

je weniger Zyklen notwendig sind, desto mehr Zielmolekül ist in der Probe

Amplifikationseffizienz nimmt durch die Anreicherung des Reaktionsproduktes Pyrophosphat kontinuierlich ab. Wenn Plateau erreicht keine Amplifikation mehr.

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TESTE DEIN WISSEN

Wie macht man eine positiv bzw. negativ Kontrolle beim PCR?

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

+ Kontrolle : zeigt prinzipielle funktionsweise der Reaktion an, zB bekannter DNA

Abschnitt um sicher zu gehen ob die Reaktion wirklich funktioniert hat

- Kontrolle: (meist ohne Zugabe von DNA) : zeigt Kontamination an, oft dH2O

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TESTE DEIN WISSEN

Sichtbarmachung von Proteinen auf Western Blot

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

vorgefärbten Proteinmarkern -> Bestätigung des Transfers auf Membran anschließende Bestimmung der Größe des Zielproteins. 

Proteine, die an Nitrocellulose und PVDF-Membranen gebunden, mit Ponceau S gefärbt werden, bindet an positiv geladenen AS Gruppen der Proteine. Färbung zur Überwachung einer gleichen Beladung und den Transfer der Proteine zu. Die Färbung leicht durch Inkubation in Wasser od. NaOH entfernt werden. Anschließend immunologische Detektion.

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TESTE DEIN WISSEN

Western-Blot Komponenten:

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

1. SDS-Page-gel

2. Einheit die elektr. Strom generiert

3. Elektrophorese Equipment

4. El. Puffer

5. Protein Transfer Einheit

6. Übertragungspuffer

7. Waschpuffer

8. Blocking Lösung

9. Primary antibody

10. Secondary Antibody (nur benötigt, wenn primary antibody nicht konjugiert ist)

11. Substrat für Enzym zB HRP-Substrat

12. X-Ray Film + Fixierer

13. Und Entwicklungslösung oder „imaging system“

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TESTE DEIN WISSEN

Denkbeispiel: Sequenz (5'-CmCGG-3') mit Bisulfit behandelt und anschließend

mit PCR vervielfacht. Anschließend noch mit Restriktionsenzymen schneidbar die 

5'-CCGG-3' erkennen?

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

Nein. 5'-CmCGG-3' wird nach Bisulfit-Behandlung zu 5'-CmUGG-3'. Dies kann das

Restriktionsenzym nicht mehr erkennen.

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TESTE DEIN WISSEN

Welche Abkürzungen gibt es für den Ct (threshold cycle) noch? Was sagt er

aus?

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

Auch:

→ Cq = quantification cycle

→ Cp = crossing point

→ TOP = Take-off-Point

Das Prinzip der qPCR ist d. wiederholende Messung des fluoreszierenden Signals

Dieses ist proportional zur Menge des vermehrten Produkts

Der Verstärkungszyklus, bei dem die Emissionsintensität des Amplifikationssprodukts Ct übersteigt, ist umgekehrt proportional zum log der Anfangszahl der Zielsequenzen

➔ Desto weniger PCR Zyklen notwendig sind um Cq zu erreichen, desto mehr

Zielmoleküle befinden sich in der Probe

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TESTE DEIN WISSEN

Wieviele Fragmente entstehen bei einem DNA Fragment, dass mit methylsensitivem Restriktionsenzym geschnitten wird

a. alle drei stellen sind methyliert

b. eine Stelle ist methyliert

c. keine Stelle ist methyliert

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

a) 3 von 3 Stellen methyliert → 1 Fragment

b) 1 von 3 Stellen methyliert → 3 Fragmente

c) 0 von 3 Stellen methyliert → 4 Fragmente


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TESTE DEIN WISSEN

Wofür wird RNAse verwendet bei der gDNA Reinigung + generell gDNAReinigung.

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

4-Schritte Prozess. 

1. Zelle lysiert.Puffer aus SDS und Proteinkinase K. zelluläre Proteine werden abgebaut. 

2. Zelllysate mit RNase verdaut, um RNA zu entfernen (darf keine DNase enthalten). 

3. zelluläre Proteine mit konz. NaCl gefällt und per Zentrifugation entfernt. Im 

4. wird die genomische DNA mit Isopropanol gefällt.

5. wird sie erneut in einem Puffer gelöst.

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TESTE DEIN WISSEN

Wähle zwischen zwei Primer, warum ist einer besser geeignet? (Anm. Beide waren gleiche Länge)

a. 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'

b. 5'-GCACGCGCGACGTCGATCGATCGA-3'

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

Primergröße: Bindungsspezifität (je kürzer, desto unspezifischer), Wahrscheinlichkeit e. Sekundärstruktur zu bilden (je länger, desto wahrscheinlicher), Kosten (je länger, desto teurer)

• Gewünschte Größe: 16-30 bp

• GC-Anteil: Der GC-Anteil des Primers sollte 40-60% betragen.

• GC-Klammer: Nicht mehr als 3 G/C sollten in den letzten 5 Basen.

• Wiederholungen: nicht mehr als 4 Dinukleotide; zb.: ATATATAT

• Runs:

Primer mit langen Runs einer einzelnen Base sollten vermieden werden 

Max. Anzahl an Runs: 4 bp; zb AGCGGGGGATGGGG


  • B, BESSER GEEIGNET


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TESTE DEIN WISSEN

Warum ist es so wichtig die Effizienz von Referenzgen und Targetgen zu bestimmen? (bei qPCR)

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

Annahme: Probe gleicher Menge an Targetgen und Referenzgen, Effizienz des einen Gens=100%, anderes=90% bei 25 Zyklen für die Quantifizierung -> berechneter Fehler bei 3,6 folds oder 360%.

wichtig!: miteinbeziehung der Effizienz des Referenzgens & Targetgens. Mit Hilfe von Standardkurven für die Target- und Referenzgensequenzen oder das LineRegPCT-Programm

Lösung ausblenden
TESTE DEIN WISSEN

Ist es sinnvoll mehr als 40 PCR Runden zu machen?

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

Nein, da die höchste Effizienz in den ersten wenigen Zyklen der PCR beobachtet

(exponentielle Phase) wird. In den späteren Phasen verläuft die Reaktion mit geringerer

Effizienz und erreicht schließlich die Beschränkungen an der Anzahl der DNAPolymerasemoleküle (d.h weniger als die Anzahl an DNA-Vorlagesträngen)

- Beschränkungen an der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase bei 95°C = 40min.)

- Beschränkung in der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in

späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von

DNA-Oligonukleotiden (Primern) an ihre entsprechenden Matrizenstränge

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  • 1110 Studierende
  • 19 Lernmaterialien

Beispielhafte Karteikarten für deinen Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK Kurs an der Universität für Bodenkultur Wien - von Kommilitonen auf StudySmarter erstellt!

Q:

Bisulfitsequenzierung: Was wird verändert , wozu genutzt? + Mechanismus, welches Nukleotid wird modifiziert?

A:

-Die Behandlung von genom. DNA mit Natriumbisulfit wandelt C in U um, während 5'-Methyl-Cytosin unbeeinflusst bleibt

-Diese diff. Umwandlung wird mit PCR nachgewiesen

-Feststellung ob ein Cytosin in der sequenzierten Region methyliert wurde oder nicht

-Methylierte Cytosinreste sind resistent gegüber d. Bisulfitumwandlung und können als Anzeige für den Status der DNA-Methylierung dienen

Q:

Wie viel Produkt hat man nach 20 PCR-Runden wenn man mit

a. einem Molekül

b. 10 Molekülen beginnt.

Warum sind diese Werte nicht in der Praxis anzutreffen?

Wieso sinkt Effizienz bei höherer cycle number?

A:

2^n-2; n= Anzahl der Zyklen

a.) 2^20-2 = 2,6 x 10^5 Kopien

b.)10* 2^20-2 = 2,6 x 10^6 Kopien

 

Parametern die die Effektivität der PCR beeinflussen:

- Beschränkung der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (zb Halbwertszeit der Taq-Polymerase bei 95°C = 40)

- Beschränkung der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von DNA-Oligonukleotiden (Primern) an entspr. Matrizenstränge

 

Verschiedene Parameter die die Effizienz der qPCR beeinflussen können (Anzahl Zyklen bevor Plateau-Phase eintritt):

je weniger Zyklen notwendig sind, desto mehr Zielmolekül ist in der Probe

Amplifikationseffizienz nimmt durch die Anreicherung des Reaktionsproduktes Pyrophosphat kontinuierlich ab. Wenn Plateau erreicht keine Amplifikation mehr.

Q:

Wie macht man eine positiv bzw. negativ Kontrolle beim PCR?

A:

+ Kontrolle : zeigt prinzipielle funktionsweise der Reaktion an, zB bekannter DNA

Abschnitt um sicher zu gehen ob die Reaktion wirklich funktioniert hat

- Kontrolle: (meist ohne Zugabe von DNA) : zeigt Kontamination an, oft dH2O

Q:

Sichtbarmachung von Proteinen auf Western Blot

A:

vorgefärbten Proteinmarkern -> Bestätigung des Transfers auf Membran anschließende Bestimmung der Größe des Zielproteins. 

Proteine, die an Nitrocellulose und PVDF-Membranen gebunden, mit Ponceau S gefärbt werden, bindet an positiv geladenen AS Gruppen der Proteine. Färbung zur Überwachung einer gleichen Beladung und den Transfer der Proteine zu. Die Färbung leicht durch Inkubation in Wasser od. NaOH entfernt werden. Anschließend immunologische Detektion.

Q:

Western-Blot Komponenten:

A:

1. SDS-Page-gel

2. Einheit die elektr. Strom generiert

3. Elektrophorese Equipment

4. El. Puffer

5. Protein Transfer Einheit

6. Übertragungspuffer

7. Waschpuffer

8. Blocking Lösung

9. Primary antibody

10. Secondary Antibody (nur benötigt, wenn primary antibody nicht konjugiert ist)

11. Substrat für Enzym zB HRP-Substrat

12. X-Ray Film + Fixierer

13. Und Entwicklungslösung oder „imaging system“

Mehr Karteikarten anzeigen
Q:

Denkbeispiel: Sequenz (5'-CmCGG-3') mit Bisulfit behandelt und anschließend

mit PCR vervielfacht. Anschließend noch mit Restriktionsenzymen schneidbar die 

5'-CCGG-3' erkennen?

A:

Nein. 5'-CmCGG-3' wird nach Bisulfit-Behandlung zu 5'-CmUGG-3'. Dies kann das

Restriktionsenzym nicht mehr erkennen.

Q:

Welche Abkürzungen gibt es für den Ct (threshold cycle) noch? Was sagt er

aus?

A:

Auch:

→ Cq = quantification cycle

→ Cp = crossing point

→ TOP = Take-off-Point

Das Prinzip der qPCR ist d. wiederholende Messung des fluoreszierenden Signals

Dieses ist proportional zur Menge des vermehrten Produkts

Der Verstärkungszyklus, bei dem die Emissionsintensität des Amplifikationssprodukts Ct übersteigt, ist umgekehrt proportional zum log der Anfangszahl der Zielsequenzen

➔ Desto weniger PCR Zyklen notwendig sind um Cq zu erreichen, desto mehr

Zielmoleküle befinden sich in der Probe

Q:

Wieviele Fragmente entstehen bei einem DNA Fragment, dass mit methylsensitivem Restriktionsenzym geschnitten wird

a. alle drei stellen sind methyliert

b. eine Stelle ist methyliert

c. keine Stelle ist methyliert

A:

a) 3 von 3 Stellen methyliert → 1 Fragment

b) 1 von 3 Stellen methyliert → 3 Fragmente

c) 0 von 3 Stellen methyliert → 4 Fragmente


Q:

Wofür wird RNAse verwendet bei der gDNA Reinigung + generell gDNAReinigung.

A:

4-Schritte Prozess. 

1. Zelle lysiert.Puffer aus SDS und Proteinkinase K. zelluläre Proteine werden abgebaut. 

2. Zelllysate mit RNase verdaut, um RNA zu entfernen (darf keine DNase enthalten). 

3. zelluläre Proteine mit konz. NaCl gefällt und per Zentrifugation entfernt. Im 

4. wird die genomische DNA mit Isopropanol gefällt.

5. wird sie erneut in einem Puffer gelöst.

Q:

Wähle zwischen zwei Primer, warum ist einer besser geeignet? (Anm. Beide waren gleiche Länge)

a. 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'

b. 5'-GCACGCGCGACGTCGATCGATCGA-3'

A:

Primergröße: Bindungsspezifität (je kürzer, desto unspezifischer), Wahrscheinlichkeit e. Sekundärstruktur zu bilden (je länger, desto wahrscheinlicher), Kosten (je länger, desto teurer)

• Gewünschte Größe: 16-30 bp

• GC-Anteil: Der GC-Anteil des Primers sollte 40-60% betragen.

• GC-Klammer: Nicht mehr als 3 G/C sollten in den letzten 5 Basen.

• Wiederholungen: nicht mehr als 4 Dinukleotide; zb.: ATATATAT

• Runs:

Primer mit langen Runs einer einzelnen Base sollten vermieden werden 

Max. Anzahl an Runs: 4 bp; zb AGCGGGGGATGGGG


  • B, BESSER GEEIGNET


Q:

Warum ist es so wichtig die Effizienz von Referenzgen und Targetgen zu bestimmen? (bei qPCR)

A:

Annahme: Probe gleicher Menge an Targetgen und Referenzgen, Effizienz des einen Gens=100%, anderes=90% bei 25 Zyklen für die Quantifizierung -> berechneter Fehler bei 3,6 folds oder 360%.

wichtig!: miteinbeziehung der Effizienz des Referenzgens & Targetgens. Mit Hilfe von Standardkurven für die Target- und Referenzgensequenzen oder das LineRegPCT-Programm

Q:

Ist es sinnvoll mehr als 40 PCR Runden zu machen?

A:

Nein, da die höchste Effizienz in den ersten wenigen Zyklen der PCR beobachtet

(exponentielle Phase) wird. In den späteren Phasen verläuft die Reaktion mit geringerer

Effizienz und erreicht schließlich die Beschränkungen an der Anzahl der DNAPolymerasemoleküle (d.h weniger als die Anzahl an DNA-Vorlagesträngen)

- Beschränkungen an der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase bei 95°C = 40min.)

- Beschränkung in der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in

späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von

DNA-Oligonukleotiden (Primern) an ihre entsprechenden Matrizenstränge

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