Lernmaterialien für Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK an der Universität für Bodenkultur Wien

-Die Behandlung von genom. DNA mit Natriumbisulfit wandelt C in U um, während 5'-Methyl-Cytosin unbeeinflusst bleibt

-Diese diff. Umwandlung wird mit PCR nachgewiesen

-Feststellung ob ein Cytosin in der sequenzierten Region methyliert wurde oder nicht

-Methylierte Cytosinreste sind resistent gegüber d. Bisulfitumwandlung und können als Anzeige für den Status der DNA-Methylierung dienen

2^n-2; n= Anzahl der Zyklen

a.) 2^20-2 = 2,6 x 10^5 Kopien

b.)10* 2^20-2 = 2,6 x 10^6 Kopien

Parametern die die Effektivität der PCR beeinflussen:

- Beschränkung der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (zb Halbwertszeit der Taq-Polymerase bei 95°C = 40)

- Beschränkung der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von DNA-Oligonukleotiden (Primern) an entspr. Matrizenstränge

Verschiedene Parameter die die Effizienz der qPCR beeinflussen können (Anzahl Zyklen bevor Plateau-Phase eintritt):

je weniger Zyklen notwendig sind, desto mehr Zielmolekül ist in der Probe

Amplifikationseffizienz nimmt durch die Anreicherung des Reaktionsproduktes Pyrophosphat kontinuierlich ab. Wenn Plateau erreicht keine Amplifikation mehr.

+ Kontrolle : zeigt prinzipielle funktionsweise der Reaktion an, zB bekannter DNA

Abschnitt um sicher zu gehen ob die Reaktion wirklich funktioniert hat

- Kontrolle: (meist ohne Zugabe von DNA) : zeigt Kontamination an, oft dH2O

vorgefärbten Proteinmarkern -> Bestätigung des Transfers auf Membran anschließende Bestimmung der Größe des Zielproteins. 

Proteine, die an Nitrocellulose und PVDF-Membranen gebunden, mit Ponceau S gefärbt werden, bindet an positiv geladenen AS Gruppen der Proteine. Färbung zur Überwachung einer gleichen Beladung und den Transfer der Proteine zu. Die Färbung leicht durch Inkubation in Wasser od. NaOH entfernt werden. Anschließend immunologische Detektion.

1. SDS-Page-gel

2. Einheit die elektr. Strom generiert

3. Elektrophorese Equipment

4. El. Puffer

5. Protein Transfer Einheit

6. Übertragungspuffer

7. Waschpuffer

8. Blocking Lösung

9. Primary antibody

10. Secondary Antibody (nur benötigt, wenn primary antibody nicht konjugiert ist)

11. Substrat für Enzym zB HRP-Substrat

12. X-Ray Film + Fixierer

13. Und Entwicklungslösung oder „imaging system“

Nein. 5'-CmCGG-3' wird nach Bisulfit-Behandlung zu 5'-CmUGG-3'. Dies kann das

Restriktionsenzym nicht mehr erkennen.

Auch:

→ Cq = quantification cycle

→ Cp = crossing point

→ TOP = Take-off-Point

➔ Das Prinzip der qPCR ist d. wiederholende Messung des fluoreszierenden Signals

➔ Dieses ist proportional zur Menge des vermehrten Produkts

Der Verstärkungszyklus, bei dem die Emissionsintensität des Amplifikationssprodukts Ct übersteigt, ist umgekehrt proportional zum log der Anfangszahl der Zielsequenzen

➔ Desto weniger PCR Zyklen notwendig sind um Cq zu erreichen, desto mehr

Zielmoleküle befinden sich in der Probe

a) 3 von 3 Stellen methyliert → 1 Fragment

b) 1 von 3 Stellen methyliert → 3 Fragmente

c) 0 von 3 Stellen methyliert → 4 Fragmente

4-Schritte Prozess. 

1. Zelle lysiert.Puffer aus SDS und Proteinkinase K. zelluläre Proteine werden abgebaut. 

2. Zelllysate mit RNase verdaut, um RNA zu entfernen (darf keine DNase enthalten). 

3. zelluläre Proteine mit konz. NaCl gefällt und per Zentrifugation entfernt. Im 

4. wird die genomische DNA mit Isopropanol gefällt.

5. wird sie erneut in einem Puffer gelöst.

Primergröße: Bindungsspezifität (je kürzer, desto unspezifischer), Wahrscheinlichkeit e. Sekundärstruktur zu bilden (je länger, desto wahrscheinlicher), Kosten (je länger, desto teurer)

• Gewünschte Größe: 16-30 bp

• GC-Anteil: Der GC-Anteil des Primers sollte 40-60% betragen.

• GC-Klammer: Nicht mehr als 3 G/C sollten in den letzten 5 Basen.

• Wiederholungen: nicht mehr als 4 Dinukleotide; zb.: ATATATAT

• Runs:

Primer mit langen Runs einer einzelnen Base sollten vermieden werden 

Max. Anzahl an Runs: 4 bp; zb AGCGGGGGATGGGG

• B, BESSER GEEIGNET

Annahme: Probe gleicher Menge an Targetgen und Referenzgen, Effizienz des einen Gens=100%, anderes=90% bei 25 Zyklen für die Quantifizierung -> berechneter Fehler bei 3,6 folds oder 360%.

wichtig!: miteinbeziehung der Effizienz des Referenzgens & Targetgens. Mit Hilfe von Standardkurven für die Target- und Referenzgensequenzen oder das LineRegPCT-Programm

Nein, da die höchste Effizienz in den ersten wenigen Zyklen der PCR beobachtet

(exponentielle Phase) wird. In den späteren Phasen verläuft die Reaktion mit geringerer

Effizienz und erreicht schließlich die Beschränkungen an der Anzahl der DNAPolymerasemoleküle (d.h weniger als die Anzahl an DNA-Vorlagesträngen)

- Beschränkungen an der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase bei 95°C = 40min.)

- Beschränkung in der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in

späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von

DNA-Oligonukleotiden (Primern) an ihre entsprechenden Matrizenstränge