Mibi Übungen an der Universität Für Bodenkultur Wien | Karteikarten & Zusammenfassungen

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Arten der Instabilität von rekombinanten Plasmiden

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segregationelle Instabilität: Schäden am Plasmid erfolgen durch fehlerhafte Aufteilung bei der Zellteilung

strukturelle Instabilität: Veränderungen in der Plasmidstruktur

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Double Antibody Sandwich ELISA mit einem enzymmarkiertenDetektionsantikörper

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Die Enzymaktivität chromogener Substrate gibt direkt Auskunft auf zweiten Antikörper und indirekt auf die Menge an gebundenem Antigen.

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Primärmetabolite

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Chemische Verbindungen, synthetisiert von den Zellen.

Werden unbedingt für den Aufbau der Zellstrukturen und den Ablauf des Stoffwechsels benötigt.


Biopolymere = DNA, Lipide, Proteine, Polysaccharide leiten sich aus den Primärmetaboliten ab

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Gärungsprodukte

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Organische Verbindungen, die beim Abbau freiwerdende H-Äquivalente aufnehmen und somit als Wasserstoffakzeptoren fungieren (Acetaldehyd)

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Wirtsorganismen für rekombinante Produktion

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E.coli, Pichia Pastoris, CHO, NS0


E.coli am meisten untersucht, leicht zu kultivieren, auch bekannte Nährstoffansprüche, bildet durch Aggregation exprimierter Proteine inclusion bodies.

Besitzt keine Möglichkeiten zu PTMs, darunter N-, O-Glykosylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen -> dann Hefen oder tierische Zellen

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Fermentator

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in unserem Beispiel Rührkessel unter Beobachtung und Steuerung von pO2, Temperatur, pH, Substratkonzentration und Produktkonzentration durch SPS

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Sekundärmetabolite

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Werden nicht für den Wachstum benötigt und unterscheiden sich vom jeweiligen Expressionssystem.

Normalerweise sekretiert, bzw. müssen "aus den Zellen herausgebracht" werden.


Insulin, Penicillin, Streptomycin, Cephalosporine

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Lag- und Beschleunigungsphase Batch-Kultur

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Zellen passen sich an das neue Milieu an, Veränderungen der Größe und Zusammensetzung der Einzelzelle. Intrazellulären Bestandteile wie DNA, Polymerasen und Enzyme werden in einem ausgewogenen Verhältnis gebildet.


Kann vermieden werden durch Vorzüchtung am selben Medium und Überimpfung aus der Wachstumsphase.

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Verzögerungsphase Batch

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Erschöüfung von Nährstoffen, Erreichen einer bestimmten Zellzahl oder Anreicherung von inhibierenden Stoffwechselprodukten

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Ks-Wert

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Substraktonzentration bei halbmaximaler Wachstumsrate μ


Maß für die Affinität von Substrat zu MO


Kleiner Ks-Wert: hohe Affinität von Substrat zu MO, niedrige Reststubstraktonzentration, hohe Produktivität


Hoher Ks-Wert: geringe Affinität zu MO, es verbleibt eine hohe Restsubstrakonzentration, Probleme mit Abwasser, schlechte Substratausnutzung.

Wachstumslimitierung tritt bei hoher S auf

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μmax

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Optimalwert für die Wachstumsrate laut Monod-Kinetik. Nur theoretisch, da Substratkonzentration gegen unendlich geht.

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​T7 - Expressionssystem

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Virale RNA-Polymerase aus der lysogenen rekombinanten lambda-Phage DE3, welches eine fünffach höhere Enzymaktivität vorweist als das von E.coli


T7-RNA-Polymerase liegt unter Kontrolle des lacUV5-Promoters (25bp), es wird aber auch ohne Induktion eine geringe Menge Polymerase gebildet.


pET = plasmid for expression by T7RNA polymerase

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Q:

Arten der Instabilität von rekombinanten Plasmiden

A:

segregationelle Instabilität: Schäden am Plasmid erfolgen durch fehlerhafte Aufteilung bei der Zellteilung

strukturelle Instabilität: Veränderungen in der Plasmidstruktur

Q:

Double Antibody Sandwich ELISA mit einem enzymmarkiertenDetektionsantikörper

A:

Die Enzymaktivität chromogener Substrate gibt direkt Auskunft auf zweiten Antikörper und indirekt auf die Menge an gebundenem Antigen.

Q:

Primärmetabolite

A:

Chemische Verbindungen, synthetisiert von den Zellen.

Werden unbedingt für den Aufbau der Zellstrukturen und den Ablauf des Stoffwechsels benötigt.


Biopolymere = DNA, Lipide, Proteine, Polysaccharide leiten sich aus den Primärmetaboliten ab

Q:

Gärungsprodukte

A:

Organische Verbindungen, die beim Abbau freiwerdende H-Äquivalente aufnehmen und somit als Wasserstoffakzeptoren fungieren (Acetaldehyd)

Q:

Wirtsorganismen für rekombinante Produktion

A:

E.coli, Pichia Pastoris, CHO, NS0


E.coli am meisten untersucht, leicht zu kultivieren, auch bekannte Nährstoffansprüche, bildet durch Aggregation exprimierter Proteine inclusion bodies.

Besitzt keine Möglichkeiten zu PTMs, darunter N-, O-Glykosylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen -> dann Hefen oder tierische Zellen

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Q:

Fermentator

A:

in unserem Beispiel Rührkessel unter Beobachtung und Steuerung von pO2, Temperatur, pH, Substratkonzentration und Produktkonzentration durch SPS

Q:

Sekundärmetabolite

A:

Werden nicht für den Wachstum benötigt und unterscheiden sich vom jeweiligen Expressionssystem.

Normalerweise sekretiert, bzw. müssen "aus den Zellen herausgebracht" werden.


Insulin, Penicillin, Streptomycin, Cephalosporine

Q:

Lag- und Beschleunigungsphase Batch-Kultur

A:

Zellen passen sich an das neue Milieu an, Veränderungen der Größe und Zusammensetzung der Einzelzelle. Intrazellulären Bestandteile wie DNA, Polymerasen und Enzyme werden in einem ausgewogenen Verhältnis gebildet.


Kann vermieden werden durch Vorzüchtung am selben Medium und Überimpfung aus der Wachstumsphase.

Q:

Verzögerungsphase Batch

A:

Erschöüfung von Nährstoffen, Erreichen einer bestimmten Zellzahl oder Anreicherung von inhibierenden Stoffwechselprodukten

Q:

Ks-Wert

A:

Substraktonzentration bei halbmaximaler Wachstumsrate μ


Maß für die Affinität von Substrat zu MO


Kleiner Ks-Wert: hohe Affinität von Substrat zu MO, niedrige Reststubstraktonzentration, hohe Produktivität


Hoher Ks-Wert: geringe Affinität zu MO, es verbleibt eine hohe Restsubstrakonzentration, Probleme mit Abwasser, schlechte Substratausnutzung.

Wachstumslimitierung tritt bei hoher S auf

Q:

μmax

A:

Optimalwert für die Wachstumsrate laut Monod-Kinetik. Nur theoretisch, da Substratkonzentration gegen unendlich geht.

Q:

​T7 - Expressionssystem

A:

Virale RNA-Polymerase aus der lysogenen rekombinanten lambda-Phage DE3, welches eine fünffach höhere Enzymaktivität vorweist als das von E.coli


T7-RNA-Polymerase liegt unter Kontrolle des lacUV5-Promoters (25bp), es wird aber auch ohne Induktion eine geringe Menge Polymerase gebildet.


pET = plasmid for expression by T7RNA polymerase

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