Introduction to Molecular Biology an der Universität für Bodenkultur Wien

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Human genome size?

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PCR main areas of application?

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PCR principle?

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PCR Components?

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what do we want to prevent concerning primers and what favors the chance?

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Pre PCR mispriming?

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Usage of primers of cDNA

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Restriction enzymes in general?

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Procaryotic Methyl Transferases?

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Introduction to Molecular Biology

Human genome size?

3234 Mbp

Introduction to Molecular Biology

PCR main areas of application?

  • medical diagnostics: identify pathogens, identify genomic mutations in patients
  • genetic engineering: preperation of any desired DNA sequence, mutagenesis (mutation, deletion, addition)

Introduction to Molecular Biology

PCR History

  • first proposed by Khorana in 1970
  • made public by Kary Mullis in 1985
  • method of the year in 1989
  • nobel prize in 1993

Introduction to Molecular Biology

PCR principle?

  1. Denaturation: 92 degrees for 20 seconds, non covalent H-bonds open up, DNA becoms single stranded
  2. Annealing of primers: ca 55 degrees, depends on lenght and composition
  3. Polymerisation: ca 72 degrees for 1' 30 sec Polymerase starts to synthesize 1000 bp per minute

Introduction to Molecular Biology

PCR Components?

  • Template
  • 2 Primers per template
  • Buffer (buffer substance, salt)
  • thermostable Polymerase (thermophillic bacteria - Thermus aquaticus, pyrococcus furiosus)

Introduction to Molecular Biology

what do we want to prevent concerning primers and what favors the chance?

  • self anneling
  • internal secondary structure
  • high chance when
    • distribution AT/GC is near 1

Introduction to Molecular Biology

Hybridization?

  • tm is the temperature at which half of the DNA is double stranded and half of the DNA is single stranded
  • annealing temperature should be 4 degrees under tm
  • we want a annealing temperature as high as possible in order to prevent unspecific annealing

Introduction to Molecular Biology

Pre PCR mispriming?

  • can happen though unspecific annealing
  • very high concentration of free primers favors unspecific annealing
  • even at room temperature Taq Polymerase has some activity and the formation of primer dimers is likely which leads to a massive loss of active primers
  • self extension of primer dimer intead of extension on the template DNA
  • Solution: small organic molecule attaches to the polymerase and is destroyed by heat so that the polymerase can take its place

Introduction to Molecular Biology

Usage of primers of cDNA

  • Oligo dT
    • + primes on poly A+mRNA
    • + crude RNA preps
    • -Rere RNA can be underpresented
  • Random pdN6
    • +large cDNA library
    • - cDNA can be small in size
    • - poly A- template can also be reverse transcribed
  • Gene specific
    • + cDNa library is enriched for specific mRNA
    • cDNA libraried can be made for specific applications, cloning all antibody encoding

Introduction to Molecular Biology

Restriction enzymes in general?

  • Def: is an enzyme that cuts DNA at or near a specific recognition nucleotide sequence
  • Differ in:
    • structure
    • cleavage site and recognition site are the same
    • cleavage site and recognition site are seperate
  • found in bacteria and archae (mechanism against invading viruses)
  • restriction modification enzyme
    • enzymes selectively sut up foreign FNA
    • host DNA ist protected by a modification enzyme that modifies the prokaryotic DNA and blocks cleavage

Introduction to Molecular Biology

Procaryotic Methyl Transferases?

  • in procaryotes Mtases are restriction/modification systems
  • most strains of Ecoli contain three DNA methylases
    • dam methylase - at N6 postion of the adine sequence GATC
    • dcm methyltransferases - methylation at C5 position of cytosine in CCAGG and CCTGG
    • EcoKI methylase - methylation of adinine in AACN6GTGC
  • some enzymes will (BamHI, BGLII, PvuI)cleave when dam methylation is present, others will not (ClaI, NruI, Taq I, XbaI)

Introduction to Molecular Biology

Gel Electrophoresis?

  • Gene materials:
    • argarose gel (routine application, longer than 200 bp)
    • polyacrylamide (short DNA fragments
  • DNA wanders to anode because of phosphate groups
  • sieve effect letzs long DNA fragments migrate more slowly

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