Introduction to Molecular Biology an der Universität für Bodenkultur Wien

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Watson and Crick?

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Identification of recombinant clones (electroporation)?

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Histone Code?

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Artificial Ribozymes?

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qPCR?

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RNA splicing?

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Regulation of DNA Replication?

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RNA Polymerase?

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DNA sequencing?

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Mutations in general?

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Gel Electrophoresis?

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PCR History

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Introduction to Molecular Biology

Watson and Crick?

  • the composition of DNA varies from one species to another
  • total amounts of pyrimidine equal to the amounts of purine: A+G=C+T
  • after Frnklin and Gosline made a xray diffraction analysis they comined the information
    • Nucleotides from a linear chein, linked by phospodiester bonds
    • DNA froms a holical double strand
    • antiparallel organization
    • minor and major groove
    • 1 double helix turn - 10 bp

Introduction to Molecular Biology

Identification of recombinant clones (electroporation)?

  • after electroporation
    • many Ecoli will have taken up one plasmid
    • very few will contain 2 oder more
    • many Ecoli cells without plasmid DNA are present
  • each plasmid molecule carries the selection marker gene (pET11a -> ampicillin)
  • on a medium containing ampicillin only Ecoli that carry a plasmid are able to grow

Introduction to Molecular Biology

Histone Code?

numerous possible combinations

  • various effects on gene expression
  • highly dynamic and reversible
  • interaction between chromatin remodelling, modification histone variants -> impacts on gene expression


Introduction to Molecular Biology

Artificial Ribozymes?

  • eg RNA Ligase ribozyme
  • developed by means of in vitro evolution and selection
  • mutagenesis with selectable phenotype
  • great potential for therapeutics
  • allows for variation
  • alternative splicing - exons of a given mRNA might be included or excluded from mature mRNA
  • trans splicing - exons from distinct mRNAs are joined and combined

Introduction to Molecular Biology

qPCR?

  • Aim: detection and quantitation of specific DNA in samples
  • medical tests (determine viurs load in sample)
  • biological test (determine the number of specific mRNA molecules in a sample)
  • Principle: rely on detection and quantification of a fluorescent signal which is proportional to the amount of formed PCR product

Introduction to Molecular Biology

RNA splicing?

  • requires two transesterification reactions
    • 2' OH end of conserved adinine involved in nuclophilic attack at introns 5' splice site
    • terminal 3' OH group of exon I initiates nucleophilic attack after the last nucleotide of the intron
    • exons are joined, intron is released in its lariat form
  • activity of spliceosome
    • contains small RNA molecules (small nuclear RNA -> snRNA)
    • associates with over 60 proteins
    • results in small nuclear robonucleo proteins (snRNPs)
  • snRNP RNA components interact with intron RNA and are essential for catalysis of splicing reactions

Introduction to Molecular Biology

Regulation of DNA Replication?

  • Initiation of replication requires cis-acting elements: Origin of Replication (ORI)
  • preferentially A-T rich sequences - facilitated DNA helix opening
  • Initiator Proteins associate with ORI
  • promotes interaction with DNA Helicase
  • DNA Primase adds RNA primer
  • replication machinery starts with DNA replication in both directions
  • replication fork ist established

Introduction to Molecular Biology

RNA Polymerase?

  • migrates along DNA double helix
  • base information of DNA template strand is scanned in 3-5 direction
  • substrate: Ribonucleoside Triphosphate (ATP, UTP, ...)

Introduction to Molecular Biology

DNA sequencing?

  • 2 types of DNA sequencing
    • Dideoxy cycle DNA sequencing:
      • for sequencing single clones
    • High troughput, next generation DNA sequencing:
      • for genome and transcriptome sequencing

Introduction to Molecular Biology

Mutations in general?

  • somatic or inherited atlerations
  • induced or spontaneous
  • driving force in selection processes

Introduction to Molecular Biology

Gel Electrophoresis?

  • Gene materials:
    • argarose gel (routine application, longer than 200 bp)
    • polyacrylamide (short DNA fragments
  • DNA wanders to anode because of phosphate groups
  • sieve effect letzs long DNA fragments migrate more slowly

Introduction to Molecular Biology

PCR History

  • first proposed by Khorana in 1970
  • made public by Kary Mullis in 1985
  • method of the year in 1989
  • nobel prize in 1993

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