Biochemie - mündlich an der Universität Freiburg im Breisgau

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Wie heißen die Komplexe der Atmungskette?

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Agarose-Gelektrophorese

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Ablauf eines Western-Blots?

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Enzym: Citrat zu Isocitrat

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Gelfiltrationschromatographie

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Wie kommt die Rotation der ATP-Synthase zustande?

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Sinn und Ablauf eines SDS-Page

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Was macht ein Enzym?

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Was passiert genau bei der GA3P-DH Reaktion? Was für eine Bindung kommt im Produkt vor? 

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Warum legen sich in der PCR die Einzelstränge nicht aneinander, bevor dies der Primer tut?

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Was passiert in Chaperonen? 

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Biochemie - mündlich

Wie heißen die Komplexe der Atmungskette?

  1. NADH-Reduktase
  2. Succinat-Dehydrogenase
  3. Cyt. C-Reduktase
  4. Cyt. C-Oxidase
  5. ATP Synthase

Biochemie - mündlich

Agarose-Gelektrophorese

  • vor allem zur Auftrennung von DNA/RNA nach ihrer Größe
  • Agarose ist ein Polysaccharid, das ein Netzwerk bildet
  • DNA-/RNA-Proben werden auf das Gel aufgetragen und über ein elektrisches Feld getrennt
  • je kleiner ein Molekül, desto schneller wandert es

Biochemie - mündlich

Ablauf eines Western-Blots?

  • Der Western Blot ist ein molekularbiologisches Verfahren zum Nachweis von Proteinen durch Übertragung (Blotting) auf eine Trägermembran. Durch verschiedene anschließende Reaktionen können dann bestimmte Proteine nachgewiesen werden.
  • Vor dem eigentlichen Western Blot muss das Proteingemisch aufgetrennt werden. Ein Beispiel wäre hier die SDS-PAGE, bei dem die Proteine im elektrischen Feld entsprechend ihrer Größe unterschiedlich weit auf einem Polyacrylamid-Gel wandern. Nachdem die Proteine nun 'sortiert' sind werden sie mit Hilfe eines weiteren elektrischen Feldes, welches senkrecht zu dem Gel steht, auf eine PVDF- oder Nitrocellulose-Membran übertragen.
  • Die Proteinbanden sind nun fest auf der Membran gebunden und können nun mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden. Am häufigsten werden hier Antikörper verwendet, die an ein bestimmtes Protein binden. Damit ein Ergebnis zustande kommt, müssen vorher die freien Bindungsstellen auf der Membran mit Proteinen, die nicht von Antikörpern erkannt werden können, blockiert werden. Dazu behandelt man die Membran z.B. mit Bovinem Serumalbumin oder einer Milchpulver-Lösung. 

    Anschließend werden zwei verschiedene Antikörper auf die Membran gegeben. Die Primärantikörper binden zunächst an das gesuchte Protein. Nach dem Entfernen unspezifisch bindender Antikörper durch Waschen wird die Membran mit einem Sekundärantikörper behandelt. Der Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper und ist z.B. an ein Enzym gekoppelt, welches eine Farbreaktion katalysiert. 

    Nach dem Auftragen der Antikörper wird die Membran mehrfach gewaschen, um alle überschüssigen Antikörper zu entfernen. Die katalysierte Farbreaktion kann nun durch Zugabe eines entsprechenden Substrats gestartet werden. In den Banden, in denen das gesuchte Protein sitzt, kann die gewünschte Farbreaktion beobachtet werden.

Biochemie - mündlich

Enzym: Citrat zu Isocitrat

Aconitase

Biochemie - mündlich

Gelfiltrationschromatographie

Gelfiltration w, Ausschlußchromatographie, Gelchromatographie, Permeationschromatographie, Molekularsieb, eine Variante der Chromatographie, bei der Moleküle nach ihrer Größe und Form auf schonende Art getrennt werden, so daß diese Methode auch sehr gut für die Trennung empfindlicher Biomolekülegeeignet ist. Grundlage einer solchen Gelfiltration ist eine mit einer speziellen Gelmatrix gefüllte Säule. Bei dieser Matrix, die mit einem Lösungsmittel im Gleichgewicht steht, handelt es sich in der Regel um ein dreidimensionales Netzwerk aus polymeren organischen Verbindungen (z.B. Dextran, Agarose [Agar], Polyacrylamid), das mit hydrophilen Poren durchsetzt ist. Große Moleküle vermögen eine solche Säule schneller zu durchwandern, da sie schlechter in die Poren der Gelmatrix eindringen können als kleinere Moleküle, welche effektiv in einem größeren Volumen verteilt sind und daher langsamer durch die Matrix gelangen (  vgl. Abb. ). Je kleiner ein Molekül also ist, desto größer ist sein Elutionsvolumen. Das Elutionsvolumen einer Molekülspezies entspricht dem Volumen Lösungsmittel, das nötig ist, um diese Moleküle von der Säule zu eluieren. Durch Vergleich des Elutionsvolumens mit dem von Molekülen bekannter Größe läßt sich die Größe einer unbekannten Molekülspezies bzw. deren relative Molekülmasse abschätzen. Daneben findet die Gelfiltration Anwendung zur Trennung und Reinigung von Makromolekülen (z.B. Proteinen, Polysacchariden, Nucleinsäuren, Hormonen, Antikörpern), zur Konzentrierung und zum Entsalzen von Lösungen oder zur Analyse reversibler Proteinbindungen. FPLC.


Biochemie - mündlich

Wie kommt die Rotation der ATP-Synthase zustande?

  1. Rotation der Fo-UE - dies setzt den zentralen Stiel des Proteins in Rotation
  2. Konformationsänderung der F1-UE - hat 3 kat. Bindungsstellen für Adenosin-Bausteine
  3. F1-UE: 3 Konformationen: L-Konformation bindet  ADP und P - T-Konformation stellt ATP her - O-Konformation entlässt ATP in die Mito-Matrix
  4. Rotation um 120° führt zur Konformationsänderung der 3 Bindungsstellen

Biochemie - mündlich

Sinn und Ablauf eines SDS-Page

  • wichtig für Nachweis von Peptidbindungen
  • Zugabe von SDS zum Proteingemisch - Folge: Denaturierung der Proteine
  • Denaturierte Proteine erhalten negative Ladungen durch die SDS-Bindung proportional zu ihrer Molekülgröße
  • Proteine wandern durch Polyacrylamidgel zur Anode und trennen sich nach ihrer Größe auf
  • Anfärben der Moleküle zum Sichtbar machen
  • Vergleich der Streifung mit einem Proteinmarker

Biochemie - mündlich

Was macht ein Enzym?

Enzyme setzen die Aktivierungsenergie einer Reaktion herab, ohne dabei die Gleichgewichtslage zu verändern - Ein Enzym ist ein biochemischer Katalysator, der die Umsetzung eines für ihn spezifischen Substratsunterstützt, selbst aber nicht chemisch verändert wird. Die meisten Enzyme gehören zur Stoffgruppe der Proteine, mit Ausnahme der Ribozyme, die aus RNA aufgebaut sind.

Biochemie - mündlich

Was passiert genau bei der GA3P-DH Reaktion? Was für eine Bindung kommt im Produkt vor? 

  • Bildung von 1,3-BPG aus GA3P - dabei Verwendung von NAD+, das zu NADH + H+ wird und Verwendung von anorganischem Phosphat - Substratkettenphosphorylierung
  • Redox-Reaktion: NAD+ wird reduziert, GA3P wird oxidiert
  • Bindung im Produkt: Säureanhydridbindung (zeichnen)

Biochemie - mündlich

Warum legen sich in der PCR die Einzelstränge nicht aneinander, bevor dies der Primer tut?

Primer liegt im Überschuss vor

Biochemie - mündlich

Was passiert in Chaperonen? 

Faltung der Proteine - cotranslational oder posttranslational und Herstellung der Sekundär- und Tertiärstruktur des Proteins

Biochemie - mündlich

Prinzip des kleinsten Zwanges nach Le Chatelier

Übt man auf ein chemisches System im Gleichgewicht einen Zwang aus, so reagiert es so, dass die Wirkung des Zwanges minimal wird.

„Zwänge“ sind in diesem Sinne Änderungen von Temperatur, Druck oder Stoffkonzentration

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