Pathobiochemie/Pathophysiologie an der Universität des Saarlandes

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MTT

Störungen

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Enzyme
Definition und Eigenschaften

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Versuch

Übersicht Assays (Vor- und Nachteile)

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Bakterien

Transformation (Transformationseffizienz, -frequenz)

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Bakterien

Restriktionsendonuklease

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Enzyme

Enzym-, Volumen- und spezifische Aktivität

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Enzyme

Enzymhemmung Übersicht

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Enzyme

Aufbau

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Versuch

Ablösen der Zellen vom Kulturgefäß

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Versuch

Verdünnung der Zellsuspension berechnen

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Versuch

cell viability

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Proteinnachweis

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Pathobiochemie/Pathophysiologie

MTT

Störungen

Störungen durch:

- reduzierende Verbindungen (z.B. Ascorbinsäure, Glutathion) können Tetrazoliumsalz nichtenzymatisch
reduzieren
- anhaltende direkte Lichteinstrahlung
-> Messung erhöhter Absorptionswerte

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Enzyme
Definition und Eigenschaften

Enzyme sind Biokatalysatoren, die biochemische Reaktionen beschleunigen können (Absenken der Aktivierungsbarriere) und dabei unverändert aus der Reaktion hervorgehen.


- besitzen spezifische Bindungsstelle: ermöglicht selektive Anlagerung und Umsetzung von Substraten sowie die Regulation der katalysierenden Reaktionen
- beeinflussen NICHT die Lage des thermodynamischen Gleichgewichts, allerdings erhöhen sie die Rate, mit der der Gleichgewichtszustand erreicht wird.
- besitzen hohe Substratspezifität (chemoselektiv, regioselektiv, enantioselektiv; Schlüssel-Schloss-Prinzip!) und Reaktionsspezifität
- sind regulierbar (allosterische Wechselwirkung, Regulatorproteine, kovalente Modifikationen (reversibel, irreversibel), verschiedene Konzentrationen an Enzym, Substrat oder Inhibitor)
- Reaktionen können gekoppelt werden (endergonische mit exergonischen Reaktionen)

-> unverzichtbar für Stoffwechsel; schwere Störungen bei Fehlen oder Inaktivität von Enzymen

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Versuch

Übersicht Assays (Vor- und Nachteile)

Tryphan Blau:

- testet Membranintegrität

- Vorteile: oft eingesetzt, günstig, einfach

- Nachteile: Apoptose/Nekrose können nicht unterschieden werden, beschränkte Sensitivität


MTT, XTT, MTS, WST:

- testet mitochondriale Aktivität

- Vorteile: oft eingesetzt, günstig

- Nachteile: lange Inkubationszeit, toxisch für Zellen, nicht für Langzeitstudien geeignet, cytotoxisch oder cytostatisch können nicht unterschieden werden, beschränkte Sensitivität, Arbeiten mit hoher Zellzahl


Calcein AM:

- testet Zellmetabolismus

- Vorteile: nicht-radioaktiv, schnell, geeignet für high-throughput-studies

- Nachteile: nicht sehr sensitiv für adherente Zellen, benötigt sensitivere Mikroskopie


LDH-Freisetzung:

- testet Membranintegrität und Zellmetabolismus

- Vorteile: oft eingesetzt, für Absorption oder Fluoreszenz

- Nachteile: niedrige Sensitivität, nicht geeignet für Langzeitstudien, falsch-positive Ergebnisse


G6PD-Freisetzung:

- testet Membranintegrität und Zellmetabolismus

- Vorteile: sensitiver und effizienter als LDH

- Nachteile: zeitaufwändig, nicht geeignet für Langzeitstudien


ATP-Assay:

- testet ATP-Produktion

- Vorteile: breite Anwendungsehr gute Sensitivität

- Nachteile: cytotoxisch oder cytostatisch können nicht unterschieden werden

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Bakterien

Transformation (Transformationseffizienz, -frequenz)

- Aufnahme exogener DNA in Bakterien; erfolgt meist nicht einfach so, sondern Bakterien müssen erst „kompetent“ gemacht werden
- Kompetenz: Zustand der es ermöglicht, exogene DNA in Zelle aufzunehmen


CaCl2-Methode:
- CaCl2-Zugabe: Calcium-Ionen neutralisieren die natürlicherweise negativ geladene DNA, wodurch diese die ungeladene Bakterienmembran leichter passieren kann, und die Phospholipid-Membran
- Hitzeschock: zuerst wird auf Eis gearbeitet, unter anderem um die Zonen der neutralisierten, leichter durchlässigen Membran zu erhalten; dann Zugabe der DNA (Plasmid), weiter kühlen; dann Hitzeschock, sodass Temperaturgradient (Zelle kalt, außen warm) die DNA-Aufnahme erleichtert


alternativ: Elektroporation; fehleranfälliger, Membran wird durch Spannung durchlässiger gemacht


Transformationseffizienz: Verhältnis zwischen transformierten Zellen und eingesetzter DNA (etwa 10^7 Kolonien/μg DNA; es ergeben sich also etwa 100 Kolonien bei 10pg eingesetzter DNA und 10^6 Kolonien bei 100ng eingesetzter DNA)

Transformationsfrequenz: Verhältnis zwischen transformierten Zellen und eingesetzten Zellen (etwa 1:1000; es wird also eine von 1000 Zellen mit Plasmid versetzt)

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Bakterien

Restriktionsendonuklease

- Enzym, das doppelsträngige DNA sequenzspezifisch schneiden (Erkennungssequenzen palindrom, zB ACGT); Hydrolysierung der H-Brücken
- teils Produzieren überstehender, kohäsiver Enden (sticky ends), spezifische Verknüpfung von DNA-Fragmenten
- Schnittmuster eines bestimmten Enzyms ist charakteristisch für das jeweilige DNA-Molekül; nach
Lagebestimmung der Schnittstellen kann man Restriktionskarte des Plasmids anfertigen

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Enzyme

Enzym-, Volumen- und spezifische Aktivität

Enzymaktivität: Maß für die Wirksamkeit eines Enzyms;
1 Unit [U] = 1 μmol Substratumsatz/min
 1 Katal [kat] = 1 mol Substanzumsatz/sec


Volumenaktivität: Ermittlung der Aktivität von Serumenzymen

= 1U/Liter Serum
   

Spezifische Aktivität: Enzymaktivität in Gewebeproben im Bezug auf den Proteingehalt der Probe

= 1U/Milligramm Protein

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Enzyme

Enzymhemmung Übersicht

irreversibel: kann nicht rückgängig gemacht werden, Hemmstoff (HS) bindet fest an aktives Zentrum, Lösen nicht möglich

zB ASS an COX1


reversibel

- kann rückgängig gemacht werden, HS bindet nicht fest an aktives Zentrum, Lösen möglich

- kompetitive Hemmung: HS ähnliche Struktur wie Substrat, bindet an aktives Zentrum aber keine Umsetzung zum Produkt, Verdrängung von Inhibitor durch höhere Substartkonzentrationen möglich

zB Alkohol-Dehydrogenase die statt Ethanol Methanol bindet -> Gabe von Ethanol zur Verdrängung

- nicht-kompetitive/allosterische Hemmung: HS bindet außerhalb von aktivem Zentrum an allosterisches Zentrum, Verformung des aktiven Zentrums sodass Substrat nicht mehr binden kann, Verdrängung durch Erhöhung der Substratkonzentration

zB oft als negative Rückkopplung bei längeren Reaktionskaskaden

- unkompetitive Hemmung: HS bindet erst an Enzym-Substrat-Komplex, Verformung des aktiven Zentrums, rückgängig  durch Verringern der Substratkonzentration

zB bei Oxidasen wenn Inhibitor nur mit einer bestimmten Oxidationsstufe des Enzyms interagieren kann

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Enzyme

Aufbau

Alle sind Proteine, außer Ribozyme (katalytisch aktive RNA-Moleküle, zB snRNA für Spleißen)


- Monomere: bestehen aus einer Proteinkette
- Oligomere: bestehen aus mehreren Proteinketten, den Untereinheiten
- Multienzymkomplexe: Zusammenlagerung mit weiteren Enzymen, kooperieren miteinander und regulieren sich gegenseitig
 - Multifunktionelle Enzyme: einzelne Proteinketten, welche mehrere Enzymaktivitäten enthalten

 

Aktives / katalytisches Zentrum: für katalytische Aktivität verantwortlich
- hochdifferenzierte Raumstruktur, die Enzymen die Fähigkeit gibt Substrate spezifisch zu binden und umzusetzen
- wird von Aminosäuren des Enzyms gebildet, die an der Substratbindung beteiligt sind
- erst durch Proteinfaltung gelangen die Aminosäuren in die räumliche Nähe zueinander
- überwiegende Bindung Substrate durch nicht-kovalente Kräfte
 

teils „Hilfsmittel“ nötig:
- Aminosäuren
- Cofaktoren (zB Metallionen, Cosubstrate (vorübergehend gebunden)
- prosthetische Gruppen (permanent gebunden))
- Aufgaben der Coenzyme: Übertragen von Gruppen (Amine, Wasserstoff, CO2, Acyl-, Alkylgruppen)
 - Beispiele für Coenzyme: ATP, NAD(P)H, FAD, Acetyl-CoA, PLP (Pyridoxalphosphat)

 

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Versuch

Ablösen der Zellen vom Kulturgefäß

mit Trypsin:

- Endopeptidase, die Peptidbindungen am Carboxylende eines Lysin oder Arginin spaltet

- wird Bauchspeicheldrüsen von Rindern oder Schweinen isoliert
- bewirkt in erster Linie eine partielle Zerstörung der Zelloberfläche, was zur Zerstörung der Oberflächen-Zellwand-Wechselwirkungen und damit zum Ablösen der Zellen führt.
- Einwirkzeit sollte möglichst gering gehalten werden, da ein zu langes Einwirken die Zellen irreversibel schädigen kan

- zusätzlich sorgt EDTA als Chelator, dass vor allem Zell-Zell-Verbindungen gelöst werden


daran zu erkennen, dass beim Schräghalten/Schwenken der Flasche gegen das Licht, die Zellen wie ein schmieriger Schleier vom Boden der Zellkulturflasche abfließen; zusätzlich wird Trypsin-Lösung milchig trübe (Zellsuspension)


Trypsinierung stoppen durch Zugabe von Medium; dann resuspendieren, zentrifugieren und in reinem Medium resuspendieren

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Versuch

Verdünnung der Zellsuspension berechnen

Ziel: in jeder Kavität (well) der 96 well-Platte sollen final 100 μL Zellsuspension mit 10^4 Zellen enthalten sein (also 10^4 Zellen pro 0,1 mL)


Rechenbeispiel:
c1 * V1 = c2 * V2
c1 = 10.000 Zellen/100 μL = 100 Zellen/μL = 100 000 Zellen/mL
V1 = 100 μL * 100 wells = 10 000 μL = 10 mL + 1 mL (Aufschlag Pipettieren) = 11 mL
(eigentlich 96 wells, aber 100 leichter zu rechnen und kleiner Aufschlag für leichteres Pipettieren aus 50 mL Falkon mit Stepper nötig)
c2 = 1 280 000 Zellen/mL (Mittelwert x 10^4)
V2 (gesucht) = c1 * V1 / c2 = 100 000 Zellen/mL * 11 mL /1 280 000 Zellen/mL = 0,8594mL
-> 859,4 μL Zellsuspension müssen in 11 mL – 0,8594 mL = 10,1406 mL Medium verdünnt werden

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Versuch

cell viability

Anzahl gesunder, lebender Zellen in einer gewissen Population/Probe (ungeachtet davon, in welcher Zellzyklusphase sich die Zellen befinden)


Indikatoren:
- Integrität/Permeabilität der Plasmamembran
- metabolische Aktivität: Enzymaktivität, ATP-Produktion, reduzierendes Milieu
- Aufnahme von Nukleotiden/DNA-Synthese

Pathobiochemie/Pathophysiologie

Proteinnachweis

Einteilung und Übersicht Techniken

spezifisch:

- Nachweis, welche Proteine genau vorliegen und Quantifizierung

- Spektrometrie 

--> HPLC, MS

- immunologische Methoden: Testmethoden, bei denen Bestandteile des Immunsystems als Nachweisreagenzien dienen (meist Antikörper: Ausnutzen der Spezifität, da Antikörper meist spezifisch nur ein Antigen detektieren)

--> ELISA, Western Blot, Dot/Slot Blot, , Durchflusszytometrie, Immunpräzipitation


unspezifische:

- Absorption (260/280 ratio)

- Kolorimetrie: qualitativ oder quantitativ

--> Xanthoprotein-Reaktion, Millon-Reagenz

--> Biuret, Lowry, BCA-Reaktion, Bradford

- Stickstoffgehaltsbestimmung

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