Mein erstes Fach an der TU Braunschweig

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Typische Kontaminationen in der Kultivierung tierischer Zellen 

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Nenne transkriptionelle Kontrollelemente + warum werden sie bei der Zelllinienentwicklung eingesetzt?

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Nenne translationale Kontrollelemente und warum sie bei der Zelllinienentwicklung wichtig sind

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Nenne Strategien für die Expression mehrerer Gene

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Warum ist der Glukoseverbrauch höher als von der Zelle benötigt ?

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Warum wird zu Beginn der Kultivierung (early exponential phase) Laktat gebildet, in welcher Phase wird das Laktat meist wieder verbraucht

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Was passiert bei der Laktatbildung mit der Zellkultur?

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Welche glycosidischen Bindungen gibt es + beteiligte Aminosäuren?

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Warum ist die Glykosylierung so wichtig bei der Herstellung von Biopharmazeutika?

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Welche Prozessparameter und Medienbestandteile haben einen Einfluss auf die Glykosylierung?

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Wie kann man Glykoproteine untersuchen?

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Unterschiede zwischen Prokaryoten und Eukaryoten

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Beispielhafte Karteikarten für Mein erstes Fach an der TU Braunschweig auf StudySmarter:

Mein erstes Fach

Typische Kontaminationen in der Kultivierung tierischer Zellen 
Art der Kontamination:
  • Virale Infektion
  • Bakterien inkl. Mykobakterien
  • Mycoplasmen
  • Pilze
  • Hefen
  • Andere Zelllinien (Kreuzkontamination)

Quellen für Kontamination:
  • Glaswaren
  • Reagenzien, Medien
  • Hilfsmittel (Schläuche, Verbinder, Schüttelkolben, Pipetten, etc.)
  • Zellen
  • Zellkeime
  • Mensch

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Nenne transkriptionelle Kontrollelemente + warum werden sie bei der Zelllinienentwicklung eingesetzt?

  • Promoter/Enhancer - Einleiten Initiation mit TF, strom auf- oder abwärts vom Promoter lokalisiert; i.d.R. zelltypspezifisch; konstutiv o. induzierbar
  • Introns - erhöht Produktivität wenn vor Transgen gesetzt
  • Polyadenylierungssignal - konservierte Sequenz (AAUAAA - 30 bp lang) am 3' - Ende der mRNA; verhindert Abbau durch Enzyme

Mein erstes Fach

Nenne translationale Kontrollelemente und warum sie bei der Zelllinienentwicklung wichtig sind

  • 5´-untranslated region (5´UTR) mit Kozak-Sequenz mit AUG-Startcodon (falsch positionierte AUG-Codons oder GC-reiche Sequenzen können sich negativ auswirken)
  • 3´-untranslated region (3´UTR), dessen Sequenz ist wichtig für mRNA-Stabilität, zB ist Tetranucletid mit Purinbase in 4. Position des Stoppcodons stabiler als mit Pyrimidinbase
  • Stopcodon 
  • codon usage (kann optimiert zu höherer Expression führen)


Mein erstes Fach

Nenne Strategien für die Expression mehrerer Gene

  • Verwendung unterschiedlicher Expressionsvektoren mit unterschiedlichen Gols
  • Zwei Genkasseten auf einem Plasmid 
  • Fusionsprotein aus zwei Proteinen
  • Verwendung von IRES (= internal ribosome entry sites)
  • mehrere cDNAs verbunden mit einem Linker, der eine Furin-Schnittstelle enthält (Furin: Endoprotease im Golgi)
  • full-size Antikörper
  • Verwendung einer 2A- Sequenz (autokatalytische proteolytische Schnittstelle)

Mein erstes Fach

Warum ist der Glukoseverbrauch höher als von der Zelle benötigt ?

Ansätze: (grün = wichtig)

  • Wiederherstellung des Redoxpotentials 
    • Durch Glykolyse entsteht NADH (Reduktionsäquivalent), welches schlecht für Zelle ist und zu NAD+ oxidiert werden muss
    • NADH muss aktiv in das Mitochondrium aufgenommen werden, Transport kann gestört werden, akkumuliert das NADH in den Zellen
    • Durch Umwandlung von Glucose in Lactat wird NADH ebenfalls oxidiert
  • Pyruvat wird von LDH abgefangen (LDH schneller als Transport in Mito)
  • Aspartat-Konzentrationen im Cytosol sind zu gering, sodass die Funktion des Malat-Aspartat-Shuttles beeinträchtgigt
  • Durch den Glutamin-Metabolismus akkumuliert NADH sowie Malat in den Mitochondrien, was ebenfalls den Shuttle stört
  • ADP-Mangel, welches in der schnellen Glykolyse verbraucht wird
  • Verlangsamte Enzymkapazität des PDH-Komplex, PEPC, Pyr.Carb.

Mein erstes Fach

Warum wird zu Beginn der Kultivierung (early exponential phase) Laktat gebildet, in welcher Phase wird das Laktat meist wieder verbraucht

  • Pyruvat wird durch Lactatdehydrogenase abgefangen und zu Laktat reduziert (LDH arbeitet schneller als das Pyruvat in das Mito aufgenommen wird)
  • Oxidation von NADH zu NAD+ durch Umwandlung von Glucose in Lactat (s. Karteikarte zu Glucoseverbrauch)
  • Verbrauch in stationärer Phase (Citratzyklus läuft auf Hochtouren, Laktat wird zu Pyruvat, welches als Acetyl-CoA in den Citratzyklus eingeht, umgewandelt)

Mein erstes Fach

Was passiert bei der Laktatbildung mit der Zellkultur?

  • Der Citratzyklus kann nur bedingt ablaufen und wird nicht durch Pyruvat sondern durch Glutamin aufrecht erhalten werden. Das bedeutet, dass wenig ATP gebildet wird
  • Oxidation von NADH zu NAD+

Mein erstes Fach

Welche glycosidischen Bindungen gibt es + beteiligte Aminosäuren?

N-glykosidische Bindung


OH-Gruppe von Kohlenhydrat + Amidgruppe von Asparagin


O-Glykosidische Bindung


OH-Gruppe von Kohlenhydrat + O-Atom aus Seitenkette von Serin oder Threonin 

Mein erstes Fach

Warum ist die Glykosylierung so wichtig bei der Herstellung von Biopharmazeutika?

Effekt auf:

  • Immunogenität (Bewirkt Immunantwort des Körpers )
  • Wirksamkeit
  • Löslichkeit
  • Stabilität
  • Halbwertszeit

des Proteins


Einfluss auf

  • Pharmakokinetik (was macht der Körper mit dem Medikament)
  • Pharmakodynamik (Was macht das Medikamt mit dem Körper)
  • Mikro- und Makroheterogenität

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Welche Prozessparameter und Medienbestandteile haben einen Einfluss auf die Glykosylierung?

  • Sauerstoffpartialdruck
  • Temperatur
  • pH Wert im Reaktor
  • Ammoniak-Gehalt
  • Glycerol-Gehalt

Mein erstes Fach

Wie kann man Glykoproteine untersuchen?

Über elektrophoretische Analysen

  • Abspaltung von N-Glykanen vom Peptidrückrat mittels des Enzyms PNGase F → Abnahme des Molekulargewichts in SDS-Page dedektierbar
  • Isoelektrische Fokussierung → Auftrennung von Proteinen und Glykoproteinen in stab. pH-Grad nach pI;
  • Isoelektrische Fokussierung mit Kapillarelektrophorese


Unter Verwendung von Lektinen:

Lektine = pflanz. (Glyko-)proteine die Kohlenhydrate spez. erkennen und binden

→ Lektin mit bekannter Kohlenhydratspez. wird mit Marker (z.B. Digoxigenin)versehen 

→ endständige Zuckerreste werden spez. erkannt und angefärbt


Über Glykanattribute:

  • Sialylation (Plasma-Halbwertszeit)
  • Galactosylation (placental Transport)
  • Core Fucosylation (ADCC)


Untersuchung von:

  • Antennary profile
  • Sialylation incl. Degree and linkae type 
  • Fucosylation
  • Galactosylation 
  • N-acetyl-lactosamine repeats
  • high mannose resdues cpmposition
  • absence of immunogenic elements such as NGNA, deactylated NANA, Gal α(1-3)Gal

Mein erstes Fach

Unterschiede zwischen Prokaryoten und Eukaryoten
Prokaryoten
  • Bakterien und Blau-Grünalgen
  • Durchmesser => 0,2 μm
  • ein DNA-Molekül, kein Zellkern (nur Nukleoid), ca. 1mm lang, geknäult
  • oft Plasmide 
  • klare Lokalisation der Organellen aber ohne Membran
  • Fortpflanzung durch Teilung
  • teils unter extremen Bed. Lebensfähig
  • Bsp: E.coli

Eukaryoten:
  • Mensch, TIer, Pflanze, Pilz, Algen
  • Durchmesser > 1 μm
  • Zellkern mit Membran
  • > 1 Chromosom
  • Zellorganellen mit Membran


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