ATBC an der TU Braunschweig

Es gibt vier verschiedene grundlegende Kultivierungstechniken:

• Agar-Platten,
• Agar-Röhrchen,
• Schüttelkolben und
• Bioreaktoren.

Essentiell für ein jedes Medium

•  C, H, N, O, S, P, Na, K.
• in großer Menge
• knapp 99 % des Trockengewichtes des Mediums

Spurenelemente

• Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Cu

Minimalmedium

• bei Organismen,deren genauen Nährstoffbedürfnisse man kennt
• nur die Elemente bzw. Verbindungen die der Organismus benötigt, um wachsen zu können
• Bsp: Glucose, (NH4)2SO4, K2HPO4, KCl, MgSO4

Komplexmedien

• genauen Bedürfnisse nicht bekannt
• verschiedene komplexe Stoffe, sodass der Organismus definitiv wachsen kann
• Bsp: Malzextrakt, Hefeextrakt und Pepton (evtl. noch + Glucose)
• variables Spektrum an Proteinhydrolysaten, Vitaminen, Spurenelementen, und Salzen

Sterilisation von Glucose gemeinsam mit Hefeextrakt

• Maillard-Reaktion
• Zucker reagiert mit im Hefeextrakt frei vorliegenden Aminosäuren zu Polymeren
• charakteristischen Braunfärbung
• Aminosäuren sind somit verloren
• Magnesium und Calcium fallen in Anwesenheit von Phosphat als unlösliche Hydrogenphosphate aus
• Lösung: separate Sterilisation, Zugabe von Komplexbildnern wie Zitronensäure oder EDTA.

• umfassendste, kostspieligste Methode: Elementaranalyse des Mikroorganismus
• Sequenzmethode: gestufte Experimente --> empirische Verbesserung
• faktorielles Design: verschiedene Faktoren verändert -->  Auswirkungen auf
  das Wachstum des Mikroorganismus beobachtet (Modifikation von n Faktoren
  Durchführung 2n analytische Versuche)
• genetische Algorithmus: bioinformatisch berechnete Vorgabe der Mediumsbestandteile durch Kombination evolutionärer Möglichkeiten auf Grundlage bekannter Bedürfnisse von Verwandten
• Chemostat (Puls- oder Shift-Experimente --> Veränderung des Wachstums beobachten

Katabolismus: 

• komplexe Stoffe unter Energiegewinnung zu einfacheren Stoffen umgesetzt
• Polysaccharide unter ATP-Gewinnung abgebaut

Anabolismus

•  Einsatz von Energie --> aus einfachen Stoffen komplexe Stoffe

Anabolismus = aufbauender Stoffwechsel
Katabolismus = abbauender Stoffwechsel

Autotrophe Organismen

• Bauen durch die Oxidation anorganischer Moleküle (Chemoautotrophe) bzw. durch Licht (Photoautotrophe) die gesamten Baustoffe für ihren Stoffwechsel aus CO2 und H2O auf
• nicht auf org. Substanzen angewiesen

heterotrophe

• organische Moleküle (z.B. Glucose) als Energiequelle 

• Glucose zu zwei Pyruvat umgesetzt
• Energie in Form von ATP und Reduktionsäquivalenten (NADH/H+)
• Startsubstanzen für die Biosynthese gewonnen

C6H12O6 + 2 ADP + Pi + 2 NAD+ →2 C3H4O3 + 2 ATP + 2 (NADH+H+) + 2 H2O

• netto 2 ATP gebildet
• pro C3-Körper zwar 2 ATP (also 2x2 = 4 ATP), bei der initialen Phosphorylierung der Glucose durch die Glucokinase bereits 2 ATP verbraucht --> 2ATP 2 NADH+H+

endet mit dem Molekül Pyruvat, dem Salz der Benztraubensäure

• entweder zu Acetyl-CoA bzw. Oxalacetat Einschleusen in Citratzyklus
• anaerob zu Lactat und Ethanol umgesetzt
• Oxalacetat: Ausgangsverbindung der Gluconeogenese
• Acetyl-CoA: Fettsäurebiosynthese

• Start: Acetyl-CoA und Oxalacetat durch Citrat-Synthase zu Citrat umgesetzt
• Anabolismus und Katabolismus parallel --> amphibolischen Prozess
• Umsetzung des C3-Körper des Pyruvats komplett zu CO2 , gleichzeitig Stoffe für die Biosynthese aufgebaut
• 1 ATP, pro C3-Körper Pyruvat 4 NADH+H+ und 1 FADH2

• glucogenen Aminosäuren wie Alanin und Glycin zu Vorstufen der Gluconeogenese umgesetzt (Pyruvat, α-Ketoglutarat)
• (Arg, His und Pro werden zunächst zu Glutamat metabolisiert und danach weiter zu α-Ketoglutarat
• ketogene Aminosäuren wie Isoleucin oder Leucin (auch Lysin und Typtophan) zu Vorstufen der Ketonkörper-Synthese (Acetyl-CoA) umgewandelt
• Serin und Threonin werden direkt desaminiert (so wird ausThreonin Acetat)
• Glutamat oxidativ oder hydrolytisch im Citratzyklus desaminiert

vier verschiedene Möglichkeiten der Sterilisation

• Hitze, hierbei wird entweder bei einem Überdruck von 1 bar und einer Temperatur von 121°C für 20 Minuten sterilisiert (im Autoklaven) oder aber bei 180°C bei Normaldruck im Trockenschrank.
• UV Bestrahlung
• Membranfiltration, hierbei werden Polysulfon bzw. Polycarbonate eingesetzt die einen Porendurchmesser < 0,2 μm besitzen.
• Chemische Stoffe, wie Ethylenoxid oder Ethanol.

Kinetik der 1.Ordnung

• −𝑑𝑁/𝑑𝑡 = 𝑘 𝑁0
• 𝑁 = 𝑁0𝑒^(−𝑘t) --> 𝑡 =1/𝑘 ln (𝑁/𝑁0)

N: Zellzahl
N0: Anfangszellzahl
t: absolute Zeit der Sterilisation [s]
k: Proportionalitätsfaktor/ Geschwindigkeitskonstante [1/s]

• Kenntnis von Keimzahl und Geschwindigkeitskonstante, Bestimmung von
  Sterilisationszeit möglich

Zellzahl

• Gesamtzellzahl (stoffwechselaktiven Zellen, abgestorbene Zellen)
  • mikroskopische Zählung in Zählkammern
  • per „cell counter“ durch eine Leitfähigkeitssonde (proportional zum
    Reziproken der Leitfähigkeit)
  • Membranfiltration: Zellen getrocknet, eingefärbt und ausgezählt,

    Konzentrationen kleiner als 106 Zellen pro mL

• Lebendzellzahl (vermehrungsfähige, lebende Zellen (cfu= colony forming units))
  • Plattenmethode: definiertes Volumen nach Verdünnung auf Agarplatte inkubieren, Kolonien gezählt (jede Kolonie entsprang aus 1 cfu), fehlerbehaftet durch Verdünnung
  • Fluoreszenzmikroskopie: Zellen mit Propidiumiodid (färbt DNA toter Zellen), Flouresceindiacetat (färbt Lebende grün) versetzt

Zellmasse

• direkten Bestimmung
  • Zellfeuchtmasse bzw. Zelltrockenmasse gewogen
• Indirekte Methoden
  • quantitative Bestimmung des N-Gehalts nach Kjeldah
  • Trübungsmessung
  • Abgasanalyse
  • Titration

• Unterschiede in zwei verschiedenen Eigenschaften
  • strukturiert, folglich unterscheidbare Komponenten verwendet
  • unstrukturiert, somit nur eine Komponente genutzt
• segregierten Modellen: heterogene, diskrete Zellen bzw. Subpopulationen
• unsegregierte Modelle: alle Zelleigenschaften in der Summe als Mittelwert

Modod-Modell

• unstrukturiertes, unsegregiertes Modell
• exponentielle Phase, Übergang in die Verzögerungsphase
• spezifische Substratverbrauchsrate ist der Proportionalitätsfaktor zwischen der
  Wachstumsgeschwindigkeit und der Biomassenkonzentration

𝑑𝑋/𝑑𝑡= 𝜇 X

𝜇 = 𝜇𝑚𝑎x S/(Ks+S)

μ: spezifische Substratverbrauchsrate [1/h]
μmax: maximale spezifische Substratverbrauchsrate [1/h]
S: Substratkonzentration [g/L]
Ks: Sättigungskonstante des Substrats [g/L]
X: Biomassenkonzentration [g/L]

• maximale Wachstumsrat bei optimalen Bedingungen in exponentieller Phase erreicht (bei 𝑆 >> 𝐾𝑠 )

• Ertragskoeffizient beschreibt, wie effektiv Biomasse unter Substratverbrauch
  gebildet wurde

𝑌𝑥/𝑠 = −(𝑑𝑋/𝑑𝑡)/(𝑑𝑆/𝑑𝑡) = −(𝑋−𝑋0)/(𝑆−𝑆0) 

Yx/s: Ertragskoeffizient (dimensionslos)

• negativen Quotienten: Zuwachs der Zellmasse und dem Verbrauch an Substrat (Substratbilanz ist negativ, deswegen wird ein negatives Vorzeichen
  benötigt, dass der Ertragskoeffizient positiv wird

• verschiedene Quellen für Mikroorganismen
  Stammsammlungen, individuelle Screenings, rekombinante Stämme und sogenannte Risikoklassen. 
• Bestimmung dieser erfolgt über Methoden wie die
  • Mikroskopie (Morphologie, Gramfärbung)
  •  Untersuchungen der Chemo-Taxonomie (z.B. Fettsäurezusammensetzung). 
  • molekularbiologische Methoden (GCGehalt, 16- bzw. 18S-rRNA-Sequenz, DNA-Hybridisierung)