Molekulare Mikrobiologie an der RWTH Aachen

CitySTADT: Aachen

CountryLAND: Deutschland

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Definieren Sie Mutation
Welche Mutationen gibt es?

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Sie möchten ein tn5 Minitransposon integrieren. Welche Stämme benötigen Sie dazu und warum?

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Wozu diente das Stanley Miller Experiment. 

Erklären Sie das Experiment 

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Verwendung von alternativem Pflanzenmaterial bei der Fermentation mit Saccharomyces cerevisiae. 

Erklären Sie Probleme und Herausforderungen. 

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Welche Klassen von Transposons gibt es? Welche Transpositions-Mechanismen kommen vor?

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Welche DNA-Reperatursysteme kennen Sie und wie sind sie definiert?

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Definieren Sie „Transposon“! 

Welche Elemente muss ein Transposon mindestens besitzen? 

Was muss beachtet werden, wenn es in der Biotechnologie als Werkzeug eingesetzt wird?

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Erklären Sie den passiven und aktiven Transport. Gehen Sie genauer auf den aktiven Transport ein, welche Unterschiede gibt es. Erklären Sie zwei genauer.

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Wie ist ein Regulon definiert?

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Inverse Metabolic Engineering: Schritte bis zum industriellen Prozess nennen 

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Auf welchen Arten kann das Lac-Operon reguliert werden?

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Sie möchten die Produktion des Stoffes “Metabolicum” in U. maydis verbessern. Leider haben sie keinerlei Wissen über den Stoffwechselweg der dem Stoff vorausgeht und es gibt auch keine Publikationen dazu. Wie gehen Sie vor? 

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Molekulare Mikrobiologie

Definieren Sie Mutation
Welche Mutationen gibt es?

Mutationen sind jegliche vererbbaren Veränderungen innerhalb der DNA-Sequenz eines Organismus

Punktmutation

Frameshift Mutation

Deletionen

Duplikationen

Insertionen

Inversionen

Molekulare Mikrobiologie

Sie möchten ein tn5 Minitransposon integrieren. Welche Stämme benötigen Sie dazu und warum?

Donorstamm, in welchem das Suizid-Plasmid stabil propagiert wird, ohne dass das Transposon in die genomische DNA transponiert wird

Helferstamm, in dem eine Mobilisierungssequenz auf einem sich selbst mobilisierenden Plasmid vorhanden ist

Akzeptorstamm, welcher rekombiniert werden soll

Molekulare Mikrobiologie

Wozu diente das Stanley Miller Experiment. 

Erklären Sie das Experiment 

Experiment zur Simulation präbiotischer Synthesen in einer künstlichen Uratmosphäre

  • Komponenten der Uratmosphäre (H20, H2, CH4 und NH3)

  • Wasser wurde innerhalb der Apparatur erhitzt und verdampft

  • Urathmosphäre wurde elektrischer Funkentladung ausgesetzt (Simuliert Blitzeinschläge) dann Kühlung und Rückführung des Kondensats in Wasserdepot 

              Betrieb über mehrere Wochen 

  • Bildung eines komplexen Gemisches in wässriger Phase (Fettsäure, Aminosäuren…)

  • Blitzeinschläge lieferten zu Beginn der Evolution Energie zur Synthese organischer Verbindungen –> Erforderliche Gasatmosphäre durch Vulkanische Aktivität vorhanden

Molekulare Mikrobiologie

Verwendung von alternativem Pflanzenmaterial bei der Fermentation mit Saccharomyces cerevisiae. 

Erklären Sie Probleme und Herausforderungen. 

S.cerevisiae kann keine Polysaccharide verwerten (Stärke, Cellulose, Hemicellulose, Pektin) à native S. cerevisiae bildet keine Cellulasen

Fermentierbare Zucker beschränken sich auf Hexosen

Durch industrielle Fermentationen werden die Hefen Stress ausgesetzt (Osmotischer Stress, Ethanol, Hitze) 

Industrielle Prozesse werden unsteril durchgeführt → Kontamination durch Milchsäure und Essigsäurebakterien

Abbauprodukte von Lignin und Pentosen sind toxisch für Mikroorganismen (setzt Vorhandensein anderer MO voraus)

Molekulare Mikrobiologie

Welche Klassen von Transposons gibt es? Welche Transpositions-Mechanismen kommen vor?

Gruppe 1

Gruppe 2

DNA-Sequenzen codiert für Proteine, die DNA direkt manipulieren können, damit die Transposons sich selbstständig im Genom vervielfältigen können

Retrotransposons, welche DNA-Kopien ihrer RNA-Transskripte anfertigen können, die dann an neuen Stellen im Genom integriert werden

Molekulare Mikrobiologie

Welche DNA-Reperatursysteme kennen Sie und wie sind sie definiert?

ReparatursystemAufgabe

Photoreaktivierung

Photolyasen spalten Pyrimidindimere wieder auf

Nucleotidexcision

Fehlerhafte DNA wird erkannt, der Einzelstrang um diese Stelle abgebaut und wieder neu synthetisiert

Basenexcision

Spezifische DNA-Glycosylasen entfernen fehlerhafte Basen und eine apurinische /apyrimidinische Stelle wird repariert

Methylabhängige 

Fehlpaarungsreparatur

der fehlerfreie Template-Strang ist methyliert, der unmethylierte Abschnitt mit einem Fehler wird abgebaut und neu synthetisiert

Rekombination

Fehlerhafte DNA wird ausgeschnitten und mit homologen Sequenzen rekombiniert

SOS-System

Fehleranfällig, wird bei starken DNA-Schäden eingesetzt

Molekulare Mikrobiologie

Definieren Sie „Transposon“! 

Welche Elemente muss ein Transposon mindestens besitzen? 

Was muss beachtet werden, wenn es in der Biotechnologie als Werkzeug eingesetzt wird?

Transposons sind mobile DNA-Elemente

  • fähig, ihre Position von einem Locus im Genom zu einem anderen zu wechseln (transponieren)
  • vorhanden in Mikroben, Pflanzen, Tieren und Menschen
  • kein eigenständiges genetisches Element
  • entschiedene Rolle bei der Vielfalt der DNA, die durch die Variationsmöglichkeiten entsteht

Benötigt:

  • Transposasegen
  • Erkennungssequenzen für Transposase

Nachteile bei Transposonsmutagenese:

  • nicht stabil
  • durch Transpositions-Aktivität kann Mutation jederzeit aus dem Gen raus

Molekulare Mikrobiologie

Erklären Sie den passiven und aktiven Transport. Gehen Sie genauer auf den aktiven Transport ein, welche Unterschiede gibt es. Erklären Sie zwei genauer.

Passiver Transport:

Transport mit dem Konzentrationsgradienten über Diffusion oder Kanäle. Benötigt keine Energie

Aktiver Transport:

Transport gegen das Konzentrationsgefälle erfordert Bereitstellung von Zellenergie

Nutzung vorhandener elektrochemischer Gradienten als Energiequelle, die durch Aktivitäten primärer Transporter entstehen können

  • Primäre Transportsysteme
  • Sekundäre Transportsysteme
  • Gruppentranslokation

 

Primärer Transport:      

Ionen-ATPasen: spezielle ATPasen, die mit einem Aufbau oder Abbau von ATP mit Teilchentransport durch eine Membran gekoppelt sind

Sekundärer Transport:  

Antiport: Transport zweier Substrate in die entgegengesetzte Richtung 

z. B. Lactococcus lactis, Sekretion des Stoffwechselproduktes Lactat und Aufnahme des Substrates Malat

Molekulare Mikrobiologie

Wie ist ein Regulon definiert?

Mechanismen, die die Anpassung an große Umweltveränderungen erlauben, indem zahlreiche Gene gleichzeitig reguliert werden

Gemeinsam regulierte Gene = Teil des korrespondierenden Regulons

Molekulare Mikrobiologie

Inverse Metabolic Engineering: Schritte bis zum industriellen Prozess nennen 

  1. Natural diversity / Evolutionary potential –> Screening / Evolution
  2. Strain with desired phenotype (which is not the production strain) –> Omics technologies / SNP detection
  3. Genotype
  4. Kownledge about genotype / phenotype relation –> Model driven hypothesis
  5. Genotype –> Genetic engineering
  6. (optimized) industrial production strain

Molekulare Mikrobiologie

Auf welchen Arten kann das Lac-Operon reguliert werden?

Negative Regulation – Repression / Induktion
Aktiv, wenn Glucose vorhanden ist –> Bindung des Repressors

Positive Regulation –> Aktivierung
Zweck: schneller Wechsel der C-Quelle von Glucose zu Lactose
Bei wenig Glucose ist cAMP Konzentration hoch und CRP kann an das Operon binden (Affinitätserhöhung)

Katabolitrepression:
Präfenzierter Katabolit reprimiert Aufnahme von Substrat

Molekulare Mikrobiologie

Sie möchten die Produktion des Stoffes “Metabolicum” in U. maydis verbessern. Leider haben sie keinerlei Wissen über den Stoffwechselweg der dem Stoff vorausgeht und es gibt auch keine Publikationen dazu. Wie gehen Sie vor? 

gTME –> Da man davon ausgehen kann, dass man Gene für globale Transkriptionsfaktoren in U. maydis kennt, wenn Organismus in der Itakonsäure-Gewinnung verwendet wird –> mit etwas Glück bildet die Mutante mehr „Metabolicum“ 

Gradient

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