Molekulare Mikrobiologie an der RWTH Aachen

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Erläutern Sie die Illumina-Methode

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Wozu diente das Stanley Miller Experiment. 

Erklären Sie das Experiment 

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Was ist MAGE?

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Wie sieht der MAGE-Zyklus aus?

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Nennen Sie die Schritte für eine MAGE

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Was unterscheidet das genannte Transposon Tn5 von Transposon Tn7?

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Nennen Sie Eigenschaften von Suizid Vektoren

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Was ist Transposition?

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Vergleichen Sie Restriktion/Ligation und Gibson-Assemblierung

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Reverse Transkriptase PCR Ablauf erklären, welche Primer werden eingesetzt und wofür?

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Welche Annahmen unterstützen die Existenz einer “RNA-Welt”?

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Was heißt „GRAS“ und was ist das?

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Molekulare Mikrobiologie

Erläutern Sie die Illumina-Methode

Methode basiert auf adaptervermittelter Anheftung zufällig fragmentierter, genomischer DNA-Stücke an eine planare, optische Oberfläche (flow cell) und einer anschließenden Festphasen-PCR → Bridge-PCR → Clusterbildung →Terminatorchemie und Floureszenzmarkierte nt nutzende Sequenzierung (hochauflösende Kamera)

1. Fragmentierung der DNA → auffüllen entstehender sticky ends + Anfügen eines A-Überhangs + Ligation von Adaptern (besitzen T-Überhang)

2. Selektion der mit Adaptern ligierten DNA

3. Anbringen der DNA an die Flow-Zell (Silicium-Chip) → über immobilisierte DNA-Sequenzen, die zu Adapter komplementär sind

4. Bridge PCR durchführen

5. Cluster-Generierung erfolgt (da Stränge bei Bridge-PCR mit benachbarten immob. Primern wechselwirken

6. Binden der Primer für Sequenzierung

7. Strangverlängerung durch erste Base (3‘ Ende reversibel mit

Floureszenzfarbstoff blockiert) + Waschschritt

8. Detektion des Fluoreszenzsignals (hochauflösende Kamera; bei 4 Basen → 4 versch. Farbstoffe)

9. Entfernen der Terminationsgruppe

10. Wiederholung des Strangverlängerungsschritts (inkl. Detektion + Terminatorentfernung)

➔ Bis Strangsequenz vollständig sequenziert

Molekulare Mikrobiologie

Wozu diente das Stanley Miller Experiment. 

Erklären Sie das Experiment 

Experiment zur Simulation präbiotischer Synthesen in einer künstlichen Uratmosphäre

  • Komponenten der Uratmosphäre (H20, H2, CH4 und NH3)

  • Wasser wurde innerhalb der Apparatur erhitzt und verdampft

  • Urathmosphäre wurde elektrischer Funkentladung ausgesetzt (Simuliert Blitzeinschläge) dann Kühlung und Rückführung des Kondensats in Wasserdepot 

              Betrieb über mehrere Wochen 

  • Bildung eines komplexen Gemisches in wässriger Phase (Fettsäure, Aminosäuren…)

  • Blitzeinschläge lieferten zu Beginn der Evolution Energie zur Synthese organischer Verbindungen –> Erforderliche Gasatmosphäre durch Vulkanische Aktivität vorhanden

Molekulare Mikrobiologie

Was ist MAGE?

MAGE =  Multiplex Automated Genome Engineering

Methode zum in vivo Genome-editing.

Mittels synthetischer ssDNA werden gezielt Modifikationen in das bakterielle Chromosom (E.coli) eingeführt. 

Es handelt sich um einen zyklischen Prozess aus Transformation der ssDNA (via Elektroporation), gefolgt von Wachstums (während dieser Phasen annealed ssDNA an Zielsequenzen in chromosomale DNA unterstützt durch „bacteriphages homologe recombination proteins“)

kann zum Erzeugen einer hohen genetischen Diversität innerhalb einer Zellpopulation (durch wiederholtes Einfügen mutierter ssDNA-Bibliotheken) genutzt werden

kann zur Einführung gezielt veränderter Allele an einer Vielzahl von Loci (àgenome-wide editing) verwendet werden

Molekulare Mikrobiologie

Wie sieht der MAGE-Zyklus aus?

1. Anzucht der Zellen (aus Starter-Kolonie)

  • Ernte in mid-log-Phase (Grund: höchste Wachstumsrate (µmax)) –> aktive Replikationsgabeln (für annealing der ssDNA-Oligos essentiell); vorher: Zelldichte zu niedrig, nachher: Beginn der stationären Phasen –> wenig aktive Replikationsgabeln
  • Zellen: MAGE-Stämme (mutS-defizientàProtein markiert normalerweise mis-matches) mit Überexpression (exo-, bet- und gam-Gene) von integrierten und hitzeschock induzierbarem λ-Prophage/ Überexprimiert ß-Protein (beta-Gen) –> stabilisiert Stränge
  • (Transient exprimierte Rekombinationsproteine (zu toxisch für konstitutiv), Endogene Reperaturproteine weisen zu geringe Grundaktivität auf)

 

2. Heatshock: Induktion der β-Protein-Expression (15 min bei T = 42°C)

  • Phagen-Gene durch pL-Promotor kontrolliert –> reguliert durch temperatursensitives mutanten Repressorprotein –> löst sich von Bindestelle –> Transkription von exo-bet-gam-Operon –> hoher β-Protein-Titer –> high frequency allelic replacement

 

3. Abkühlen + Waschen

  • 4 °C: verhindert Degradation –> laut VL: senkt man dadurch die ß-Proteinexpression (dieses Protein wirkt in hoher Konz. zelltoxisch)
  • Waschen: Beseitigt Elektrolyte –> senkt Leitfähigkeit und verhindert die Entstehung von Lichtbögen bei Elektroporation (Gefahr: Zelltod)

 

4. Zugabe der synthetisierten Oligos + Elektroporation

  • Oligos: 3‘ und 5‘-Terminus –> flankierende homologe Arme, komplementär zu Zielsequenz im Genom; in der Mitte: Sequenz mit spezifischer Mutation (Deletion/Mismatch/Insertion)

 

5. Regeneration der Zellen + Fortsetzung des Wachstums 

  • (ablaufende Replikationen –> stabiler Einbau der Oligo-Sequenzen –> Übernahme der mutierten Sequenz)

 

6. Neuer Zyklus

  • 6-10 Zyklen dann sind nahezu alle Zellen mit Mutation versehen
  • Einführung weiterer Mutationen

Molekulare Mikrobiologie

Nennen Sie die Schritte für eine MAGE

1. Gewünschten Phänotypen/ Genotypen definieren

2. Auswählen des Ziel-Locus/ der Ziel-Loci („target-loci“)

3. Designen der ssDNA-Oligos für Modifikation der „target-sites“

4. Berechnen/ Abschätzen der erforderlichen Zyklus zahlen

5. Durchführung der MAGE-Zyklen

6. Identifikation der gewünschten Klone 

(Screening/Selektion):

  • Visuelles Screening (nur bei sichtbaren Phänotypen)
  • Mittels Selektionsmedium (nur bei selektierbaren Phänotypen –> ermöglich Hochdurchsatz Screening)
  • MACE-PCR (multiplex allele-specific colony PCR, mit 3 Primern: (i) forward primer (fWT) spezifisch für WT sequence, (ii) forward primer spezifisch für mutierte Sequenz (fmut) und (iii) ein reverse primer der in einer nicht mutierten Region bindet und damit eine Amplifikation beider Allele unterstützt –> siehe MACE-PCR).

Molekulare Mikrobiologie

Was unterscheidet das genannte Transposon Tn5 von Transposon Tn7?

Transposon Tn5

Transposon Tn7

Ungerichtete genomische Integration

Gezielte genomische Integration

Molekulare Mikrobiologie

Nennen Sie Eigenschaften von Suizid Vektoren

  • Stabile Integration ins Genom 
  • Transposase für die Transposition notwendig 
  • Gezielte oder zufällige Integration 
  • Transposon-tragende Plasmide sind Suizid Vektoren (keine Replikation im Akzeptor Stamm möglich) 
  • Antibiotika für die Stabilität nicht notwendig, aber für die Selektion 
  • Eine Kopie pro Zelle 
  • Nicht für knock outs geeignet (bei spez. Insert.)à kann mit Tn5 aber zufällig passieren (da ungerichtete Insert.)
  • Vorteil gegenüber Plasmiden 
  • Weniger Einfluss auf die Wachstumsrate 
  • Keine schwankenden Kopienzahl (Bestandteil des bakt./(euk.) Chromosoms)
  • Müssen nicht durch Antiobiotika stabilisiert werden

Molekulare Mikrobiologie

Was ist Transposition?

Die Transposition ist ein Rekombinationsprozess, bei dem sich als transponierbare Elemente bezeichnete DNA-Sequenzen von einer ursprünglichen Stelle auf einem DNA-Molekül zu einer neuen Stelle auf demselben oder einem anderen DNA-Molekül bewegen. Insertionen können Einfluss auf die Genaktivität haben. Die Genome prokaryotischer und eukaryotischer Organismen enthalten diese Elemente.

Molekulare Mikrobiologie

Vergleichen Sie Restriktion/Ligation und Gibson-Assemblierung

Restriktion / Ligation

Gibson-Assemblierung

  • unterschiedliche Schnittstellen
  • viele versch. Restriktionsenzyme
  • keine nahtlose Fusion
  • Länge der Inserts begrenzt (PCR)
  • 1 Fragment pro Reaktion
  • Dauer relativ lang, da viele zeitintensive Schritte
  • 1 bzw. keine Schnittstelle
  • 1, 2 bzw. keine Restriktionsenzyme
  • nahtlose Fusion
  • Länge der Inserts unbegrenzt
  • viele Fragmente pro Reaktion (>9)
  • Dauer relativ kurz da 1 Schritt von 15 Minuten

Molekulare Mikrobiologie

Reverse Transkriptase PCR Ablauf erklären, welche Primer werden eingesetzt und wofür?

Kombination aus reverse transkription und PCR zum Nachweis von RNA

RNA-Reinigung und DNA umschreiben und amplifizieren

Für Nachweis von Transkription eines Genes, etc –> reverse Transkription

Schritte

  • RNA-abhängige DNA-Polymerase, die RNA in cDNA umschreiben kann
  • Anschließende Amplifiktation nur der cDNA durch PCR 
  • Zwischen Schritten Erhitzung auf 95°C möglich, um reverse Transkriptase zu denaturieren

 

Oligo-d(T)-Primer

(mehrere Thymin-Basen, die komplementär zum Poly(A)-Schwanz am 3’Ende der mRNA sind) 

wichtig für RNA-abhängige DNA-Polymerase

Schleifen-Primer

für sehr kurze RNA-Stücke (hybridisieren am 3’Ende mit unter 10 Basen); schreiben microRNA um, statt mRNA

Gen-spezifische Primer 

erst im 2. Schritt der PCR

Molekulare Mikrobiologie

Welche Annahmen unterstützen die Existenz einer “RNA-Welt”?

Hypothese:

heutigem Lebensformen ging eine Welt voraus, deren Leben auf RNA als universellen Bausteinen zur Informationsspeicherung und zur Katalyse chemischer Reaktionen basierte –> in der Evolution zunehmend durch chemisch stabilere DNA abgelöst.

Hinweis 1 auf Existenz der RNA-Welt: 

Ribozyme (katalytisch aktive RNA-Moleküle, die wie Enzyme chemische Reaktionen katalysieren) z.B. rRNA

  • Polymerisierung von Nukleotiden durch RNA
  • Bereitstellung von „Bauplänen“ für RNA-Moleküle, die neue RNA mittels eines RNA-Templates herstellen können

–> RNA kann als einziges Molekül sowohl als Template für seine eigene Replikation dienen, als auch diese Replikation selbst katalysieren

–> Annahme: RNA als initiales genetisches System

Hinweis 2 auf Existenz der RNA-Welt: 

Die Desoxyribonucleotide, aus denen die DNA zusammengebaut wird, werden in Zelle aus Ribonucleotiden (RNA-Bausteine) erzeugt indem die 2′-Hydroxygruppe entfernt wird, d.h. Zelle muss also erst in der Lage sein, RNA aufzubauen, bevor sie DNA herstellen kann.

Die vier Ribonucleotide können unter bestimmten Umweltbedingungen spontan entstehen

Molekulare Mikrobiologie

Was heißt „GRAS“ und was ist das?

GRAS = Generally Recognized As Safe 

in USA Zulassungsbezeichnung der Food and Drug Administration (FDA), welche die Unbedenklichkeit eines Stoffes (Salze, Aromastoffe, Farbstoffe) als Lebensmittelzusatzstoff kennzeichnet

GRAS-Status auch für Stoffe die von gentechnisch veränderten Organismen produziert werden

In Erweiterung der ursprünglich auf Stoffe eingeschränkten Definition werden gelegentlich auch solche Organismen als GRAS (GRAS-Organismen) bezeichnet, von denen generell keine Gefahr für Mensch und Umwelt ausgeht und die deshalb uneingeschränkt für gentechnische Arbeiten sowie in der biotechnischen Produktion (Biotechnologie) eingesetzt werden können.

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