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Lernmaterialien für Design of biological molecules an der RWTH Aachen

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TESTE DEIN WISSEN

Sie wollen bei einem gelenkten Evolutionsexperiment (epPCR, 96er MTP) die Lösungsmittelstabilität für DMSP einer Monooxygenase erhöhen. Ein kolorimetrisches Durchmusterunssystem zum Aktivitätsnachweis ist etabliert. Wie könne Sie Expressionsmutanten (höhere Expression, und damit höhere Gesamtaktivität aber keine höhere Stabilität) eliminieren? Erklären Sei im Detail Ihr experimentelles Vorgehen und wie damit Expressionsmutanten identifiziert werden.

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TESTE DEIN WISSEN

→Referenzplatte ohne Lösungsmittel -> Gesamtaktivität

→Replikate mit Lösungsmitteln -> reduzierte Aktivität

→Verhältnis identifizierte Stabilitätsmutanten und eliminiert Expressionsmutanten

→in normalem Mittel kann die Aktivität der Aspekte bewertet werden und im LM die Stabilität und dann daraus der Verhältnis bestimmen

→je weiter die Aktivität wiederum absinkt im LM, desto schlechter die Stabilität

→ Gesamtaussage

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Benennen Sie einen Vorteil und einen Nachteil der fehlerhaften PCR mit universellen/degenerierten Basen im Vergleich zur „standardfehlerhaften PCR“, die MnCl2 einsetzt, um die Mutagenesefrequenz einzustellen (2x1= 2.0 Punkte).

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→ + →es ist Besonders einfach in der Handhabung und kann einfacher durchgeführt werden, es kann eine höhere Mutationsfrequenz jeweils eingebaut werden, universelle Basen bestimmen Mutationen mit, damit auch Transversionen möglich sind (gleichbedeutend mit höherer chemischer Vielfalt)


→ - →es kann nur sehr wenig PCR Produkt gebildet werden, weil sich diese unnatürliche Basen aufgrund der anderen Form nicht so gut einbauen lassen, degenerierten Basen oder bei hoher Mutagenesefrequenz kein PCR produkt.

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In der epPCR mit degenerierten Basen werden P (N4-methoxycytidine) in Form von dPTP und K (3,4.dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin- 7-one) in Form von dKTP eingesetzt. Mit welchen natürlichen Basen paaren P und K? Eine Erläuterung ist nicht nötig (2x0.5 + 2x 0.5=

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→P with A and G K with C and T

→P paart zu 60% mit Adenin und 40% mit Guanin

→K paart zu 13% mit Cytosin und zu 87% mit Thymin

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Sie mutagenesieren eine Protease einmal mittels fehlerhafter PCR (epPCR) und einmal mittels der SeSaM-Methode und durchmustern jeweils 3000 Klone um die

Temperaturstabilität zu erhöhen. Bei beiden Methoden haben Sie die gleiche Mutagenesefrequenz eingestellt, die zu einer Aminosäuresubstitution pro mutiertem Gen führt. Ferner haben Sie bei der SeSaM-Methode die Bevorzugung in den „Nukleotideaustauschen“ (Mutationen) so eingestellt, dass Transitions- und Transversionsmutationsbevorzugungen identisch sind zur epPCR. Liefert eine der beiden Methoden eine höhere Erfolgschance um temperaturstabile Varianten aufzufinden oder haben beide Methoden die gleiche Erfolgswahrscheinlichkeit. Begründen Sie ihre Einschätzung detailliert (0 + 1 + 1.5= 2.5 Punkte).

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→epPCR targets gene positions with the transition bias so that many positions are preferentially or not targeted in a gene. SeSaM targets each nucleotide position without a polymerase bias. Therefore more positions are targeted in SeSaM then in epPCR libraries.

→SeSAM auch die Wahrscheinlichkeit für aufeinanderfolgende Änderungen größer und damit, dass es mehr chemisch veränderte Austausche geben kann, welche dann eine größere chemische Änderung herbeiführen

→der genannte Bias wirkt sich erst später aus und nicht direkt bei der SeSam Methode, sodass es an sich eine Variante ohne Bias ist (dieser wirkt sich erst bei der Auffüllung der universellen Basen aus)

→Since more positions are targeted the likelihood of finding improvements is higher with SeSaM despite of the identical mutational bias. (1 Point, conclusion)

→SeSaM mit mehr veränderten Positionen (auch hintereinander) und damit die höhere Wahrscheinlichkeit für großflächige Änderungen in dem jeweiF10ligen Molekül

→Bias bei der Polymerase nicht weil man universelle Base hat und dadurch in Kombination mit Polymerase, schönere Variation in SeSam, weil ich aufeinanderfolgende austausche habe was beim anderen nicht vorhanden ist (wenn alles andere gleich ist aufeinanderfolgend der Große unterschiede)

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Sie entwickeln zwei Zufallsmutagenesemethoden und mutagenisieren separat mit jeder dieser beiden Methoden das gleiche Gen. Eine Methode generiert an jeder Position im Protein ein Alanin; die Zweite generiert jeweils ein Glycin. Für welche der beiden Methoden erwarten Sie mehr Proteinvarianten mit verringerter Temperaturstabilität? Begründen?

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→Glycin Helixbrecher – verringert Stabilität→ verringerte Wirkung 

→Glycin kann keine Wasserstoffbrücken bilden und deswegen weitere Abnahme der Stabilität (fehlender Faktor), außerdem erhöht Glycin aufgrund seiner fehlenden Chiralität die Flexibilität und dies ist bei Proteinen und Temperaturstabilität immer nachteilig 

→bei Temperaturstabilität ist Flexibilität hinderlich, weil man eher rigide Strukturen braucht an denen das Protein nicht auseinander brechen kann 

→wenn man mehr aktive Varianten haben möchte (unabhängig von Temperatur)→ dann wird die Struktur ohne Glycin bevorzugt, weil dann weniger helixbrechende Strukturen eingesetzt werden und damit mehr die für uns notwendige Struktur beibehalten wird

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Sie entwickeln zwei Zufallsmutagenesemethoden und mutagenisieren separat mit jeder dieser beiden Methoden das gleiche Gen, um die Temperaturstabilität zu erhöhen. Eine Methode generiert an jeder Position im Protein ein Glutamat; die Zweite generiert jeweils ein Alanin. Für welche der beiden Methoden erwarten Sie eine höhere Anzahl an thermostabileren Proteinvarianten? Begründen Sie detailliert Ihre Einschätzung (0 + 3= 3 Punkte).

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→Höhere Anzahl an thermostabileren Varianten bei Methode A) mit Glutamat, da dieses Ionische WW und Wasserstoffbrücken eingehen kann, welche das Protein stabilisieren und somit die Flexibilität erniedrigt aber nicht im schlechten Maßstab 

→(für thermostabilere Varianten müssen Ladungssubsitutionen erzeugt werden

→ WW mit AS mit entgegengesetzter Ladung) →Flexibilität erniedrigt für Temperaturstabil→ daher braucht es stabilere und stärkere Bindungen

→ z.B. ionische Wechselwirkungen (zusammen mit positiven AS) Salzbrücken bilden und sollte die Temperaturstabilität erhöhen; Alanin ist neutral und kann keine starken Wechselwirkungen eingehen 

→(negative AS auf der Oberfläche erhöhen Stabilität siehe Subtilitin)

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In einem Gelenkten Evolutionsexperiment finden Sie eine Mutante, die eine höhere Thermostabilität hat. Ein Alanin ist an dieser Position durch ein Cystein ersetzt und biophysikalische Charakterisierungen ergeben, dass die Stabilität durch eine neue Disulfidbrückenbindung erzielt wird. Für die Vielfaltsgenerierung auf DNA-Ebene haben Sie die epPCR Methode verwendet. Wie schätzen Sie die Erfolgsaussichten ein, mittels Sättigungsmutagenese (z.B. QuikChange) an dieser Position noch thermostabilere Varianten aufzufinden? Begründen Sie detailliert Ihre Einschätzung (0 + 2.5 = 2.5 Punkte).

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→es kann nur Cystein Disulfidbrücken ausbilden und wenn dies als angesprochener Grund bewertet wird dann kann keine weitere Verbesserung eingeleitet werden

→Disulfidbrücken sind kovalente Bindungen, daher stärker als hydrophobe WW, H Brücken oder ionische Wechselwirkung und deswegen keine weitere Steigung möglich

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Sie wollen die Schmelztemperatur von DNA erniedrigen durch Zugabe eines wassermischbaren Lösungsmittels. Welches würden Sie verwenden, erläutern Sie die Schmelzpunktserniedrigung der doppelsträngigen DNA auf molekularer Ebene (0 + 1 +1= 2.0

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→Erlärung muß enthalten: ein Lösungsmittel wie DMSO/THF oder Alkohole (Butanol und höherkettige Alkohole sind nicht mehr ausreichend wassermischbar), die wassermischbar sind und selber H-Brücken bilden können (1 Punkt); letzteres schwächt die H-Brückenbildung zwischen den DNA Strängen und reduziert die Schmelztemperatur (1 Punkt).

→es darf nicht zu hydrophob sein, weil sonst die Funktion nicht mehr gewährleistet ist und die auch die Löslichkeit nicht mehr ausgeprägt ist→ es bietet sich beispielswiese Ethanol, DMSO an und es müssen die H Brücken geschwächt werden, weil diese die Stabilität bestimmt.

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Aus einem Gelenkten Evolutionsexperiment erhalten Sie 10 mutierte Gene (Länge 3000 Basenpaare). Jedes Gen trägt jeweils in einem Codon eine Mutation, die zu einem einzigartigen Aminosäureaustausch führt und die Aktivität des Enzyms um den Faktor zwei verbessert. Sie stellen eine Mischung aus allen 10 mutierten Genen her und führen ein StEP Experiment durch. Um zu sehen, ob die neue Mutantenbibliothek eine hohe Qualität besitzt, picken Sie 20 Klonie von der Agarplatte, isolieren die Plasmide und sequenzieren 20 Gene

ohne vorherigen Aktivitätstest. Sie finden nur die Wildtyp- Sequenz. Woran liegt dies? Erklären Sie letzteres auf molekularer Ebene? (0 + 3 = 3.0 Punkte).

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The staggered extension process (also referred to as StEP) is a technique (modified PCR) to create new, mutated genes with qualities of one or more initial genes


Da jedes Gen nur eine Mutation in einem bestimmten Codon enthält, ist das entsprechende Codon in allen anderen Genen unmutiert.

Hybridisierung der Fragmente ist statistisch und da mehr wt-Fragmente vorhanden sind, baut sich am ehesten wt-DNA zusammen -> Exponentielle zunahme der wt-DNA führt zum austitern der Mutation-tragenden Fragmente


→Da jedes Gen nur eine Mutation enthalt sind 9 Gene pro Positionen vorhanden, die keine Mutation aufweisen. Da die Hybridisierung der Fragmente rein statistisch erfolgt (nahzu identische Gene) wird bevorzugt pro Zyklus die Wildtyp-Sequenz ampflifiziert. Da bei der PCR DNA exponentiell vermehrt wird, wird nach bereits 10 Zyklen nahezu ausschließlich die Wild- typ-Sequenz vorhanden sein.

→es wird pro Gen nur eine Mutation enthalten, dh man hat 9mal mehr den Wildtyp und damit bei dieser reduzierten Anzahl an Klonen deutlich höhere Wahrscheinlichkeit für diese Klone

→10 Gene zusammen und dann DNA exponentiell vermehrt und dann fast nur Wildtyp pro 1 Mutation 9 ohne Mutationen (Unterschied durch exponentielle Vermehrung immer mehr), verliert man durch geringen Anteil deswegen fast nur Wildtyp obwohl alles da (alle 10 Mutationen auf ein Gen und dann mit WT und dort dann mischen)


wtf diggi hat er hier geschrieben?

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Sie haben in einem Gelenkten Evolutionsexperiment zur Erhöhung der Enantioselektivität vier Aminosäurepositionen in der Bindungstasche identifiziert. Sie sättigungsmutagenisieren jede Positionen einzeln und nacheinander z.B. in vier aufeinanderfolgenden QuikChange Experimenten (Strategie 1); alternativ mutagensieren Sie alle vier Positionen auf einmal (Strategie 2)? Erwarten Sie für die „selektivste Variante“ einer jeden „Strategie“ die gleiche Aminosäuresequenz an allen vier Positionen aufzufinden oder nicht? Begründen Sie im Detail und auf molekularer Ebene Ihre Einschätzung (0 + 3= 2.0 Punkte).

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→(Zusammenspiel der Aminosäuren sehr wichtig, evtl. Verschlechterung bei Veränderung nur einer aber Verbesserung bei Austausch von mehreren)

→Nein. Beim Einfügen einzelnen AS wird die Wechselwirkung von verschiedenen AS untereinander nicht berücksichtigt. Der Austausch von vielen AS gleichzeitig bringt Interaktionen der verschiedenen AS Seitenketten mit sich und zeigt so Aktivitäten, die im anderen Experiment nicht erfasst worden wären.

→cooperative Effects among the close and interacting site chains can be found→ aber nur von Relevanz wenn die Stellen auch nahe beeinander liegen sonst nicht beachtne

→ Multi-site ist besser, Grund sind kooperative Effekte zwischen den engen und interagierenden Ketten, die gefunden werden können. Kooperative Effekte können bessere Ergebnisse liefern als die beste single-substitution an jeder Position.

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Sie haben in einem gelenkten Evolutionsexperiment zur Erhöhung der Thermostabilität zwei Aminosäurepositionen in einem Loop-Bereich identifiziert. An beiden Positionen befindet sich die Aminosäure Alanin. Strategie 1: Sie sättigungsmutagenisieren mittels QuikChange die beiden Positionen einzeln und nacheinander und durchmustern jeweils 1000 Klone. Für die zweite Sättigungsmutagenese verwenden Sie die beste Varainte aus der ersten Runde. Strategie 2: Sie sättigungsmutagenisieren beide Positionen gleichzeitig und durchmustern 2000 Klone.

Erwarten Sie thermostabilere Variante für Strategie 1 oder 2?

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→Multi site saturation yields better results due to cooperative effects among the two site chains. For thermostability two charged substitutions with opposite charge have to be generated. Single site saturation likely will not lead to improved thermal resistance since a single charge is insufficient to hold the loop together

→Single-Site-Sättigung führt wahrscheinlich nicht zu einer verbesserten thermischen Beständigkeit, da eine einzelne Ladung unzureichend ist, um die Schleife zusammen zu halten.

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In einem Gelenkten Evolutionsexperiment finden Sie drei Aminosäurepositionen, die die Aktivität signifikant erhöhen und räumlich in der Bindungstasche benachbart liegen. Sie führen zwei Experimente durch: Im ersten Experiment mutieren Sie mittels QuikChange (Sättigungsmutagenese) jede der drei Positionen nacheinander. Im zweiten Experiment sättigungsmutagenisieren Sie alle drei Positionen mittels Quikchange gleichzeitig. Was für ein Ergebnis erwarten Sie: Liefern beide Vorgehensweisen die gleichen Aktivitätsverbesserungen und die gleichen Aminosäuresubstitution an den drei ausgewählten Positionen? Begründen Sie Erwartung (0+2= 2.0 Punkte).

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TESTE DEIN WISSEN

→Beim Einfügen einzelner AS wird die Wechselwirkung von verschiedenen AS untereinander nicht berücksichtigt. Austausch vieler AS gleichzeitig bringt Interaktion der verschiedenen AS Seitenketten mit sich und zeigt so Aktivitäten die im anderen Experiment nicht erfasst worden wären. Es ist wahrscheinlicher, dass die kombinatorischen Aspekte zu einem größeren Erfolg führen (verschiedene Ausgangswege), weil dort die Bindungsstruktur der einzelnen Aspekte beachtet werden kann

→Nein. Beim Einfügen einzelner AS wird die Wechselwirkung von verschiedenen AS untereinander nicht berücksichtigt.

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Beispielhafte Karteikarten für deinen Design of biological molecules Kurs an der RWTH Aachen - von Kommilitonen auf StudySmarter erstellt!

Q:

Sie wollen bei einem gelenkten Evolutionsexperiment (epPCR, 96er MTP) die Lösungsmittelstabilität für DMSP einer Monooxygenase erhöhen. Ein kolorimetrisches Durchmusterunssystem zum Aktivitätsnachweis ist etabliert. Wie könne Sie Expressionsmutanten (höhere Expression, und damit höhere Gesamtaktivität aber keine höhere Stabilität) eliminieren? Erklären Sei im Detail Ihr experimentelles Vorgehen und wie damit Expressionsmutanten identifiziert werden.

A:

→Referenzplatte ohne Lösungsmittel -> Gesamtaktivität

→Replikate mit Lösungsmitteln -> reduzierte Aktivität

→Verhältnis identifizierte Stabilitätsmutanten und eliminiert Expressionsmutanten

→in normalem Mittel kann die Aktivität der Aspekte bewertet werden und im LM die Stabilität und dann daraus der Verhältnis bestimmen

→je weiter die Aktivität wiederum absinkt im LM, desto schlechter die Stabilität

→ Gesamtaussage

Q:

Benennen Sie einen Vorteil und einen Nachteil der fehlerhaften PCR mit universellen/degenerierten Basen im Vergleich zur „standardfehlerhaften PCR“, die MnCl2 einsetzt, um die Mutagenesefrequenz einzustellen (2x1= 2.0 Punkte).

A:

→ + →es ist Besonders einfach in der Handhabung und kann einfacher durchgeführt werden, es kann eine höhere Mutationsfrequenz jeweils eingebaut werden, universelle Basen bestimmen Mutationen mit, damit auch Transversionen möglich sind (gleichbedeutend mit höherer chemischer Vielfalt)


→ - →es kann nur sehr wenig PCR Produkt gebildet werden, weil sich diese unnatürliche Basen aufgrund der anderen Form nicht so gut einbauen lassen, degenerierten Basen oder bei hoher Mutagenesefrequenz kein PCR produkt.

Q:

In der epPCR mit degenerierten Basen werden P (N4-methoxycytidine) in Form von dPTP und K (3,4.dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin- 7-one) in Form von dKTP eingesetzt. Mit welchen natürlichen Basen paaren P und K? Eine Erläuterung ist nicht nötig (2x0.5 + 2x 0.5=

A:

→P with A and G K with C and T

→P paart zu 60% mit Adenin und 40% mit Guanin

→K paart zu 13% mit Cytosin und zu 87% mit Thymin

Q:

Sie mutagenesieren eine Protease einmal mittels fehlerhafter PCR (epPCR) und einmal mittels der SeSaM-Methode und durchmustern jeweils 3000 Klone um die

Temperaturstabilität zu erhöhen. Bei beiden Methoden haben Sie die gleiche Mutagenesefrequenz eingestellt, die zu einer Aminosäuresubstitution pro mutiertem Gen führt. Ferner haben Sie bei der SeSaM-Methode die Bevorzugung in den „Nukleotideaustauschen“ (Mutationen) so eingestellt, dass Transitions- und Transversionsmutationsbevorzugungen identisch sind zur epPCR. Liefert eine der beiden Methoden eine höhere Erfolgschance um temperaturstabile Varianten aufzufinden oder haben beide Methoden die gleiche Erfolgswahrscheinlichkeit. Begründen Sie ihre Einschätzung detailliert (0 + 1 + 1.5= 2.5 Punkte).

A:

→epPCR targets gene positions with the transition bias so that many positions are preferentially or not targeted in a gene. SeSaM targets each nucleotide position without a polymerase bias. Therefore more positions are targeted in SeSaM then in epPCR libraries.

→SeSAM auch die Wahrscheinlichkeit für aufeinanderfolgende Änderungen größer und damit, dass es mehr chemisch veränderte Austausche geben kann, welche dann eine größere chemische Änderung herbeiführen

→der genannte Bias wirkt sich erst später aus und nicht direkt bei der SeSam Methode, sodass es an sich eine Variante ohne Bias ist (dieser wirkt sich erst bei der Auffüllung der universellen Basen aus)

→Since more positions are targeted the likelihood of finding improvements is higher with SeSaM despite of the identical mutational bias. (1 Point, conclusion)

→SeSaM mit mehr veränderten Positionen (auch hintereinander) und damit die höhere Wahrscheinlichkeit für großflächige Änderungen in dem jeweiF10ligen Molekül

→Bias bei der Polymerase nicht weil man universelle Base hat und dadurch in Kombination mit Polymerase, schönere Variation in SeSam, weil ich aufeinanderfolgende austausche habe was beim anderen nicht vorhanden ist (wenn alles andere gleich ist aufeinanderfolgend der Große unterschiede)

Q:

Sie entwickeln zwei Zufallsmutagenesemethoden und mutagenisieren separat mit jeder dieser beiden Methoden das gleiche Gen. Eine Methode generiert an jeder Position im Protein ein Alanin; die Zweite generiert jeweils ein Glycin. Für welche der beiden Methoden erwarten Sie mehr Proteinvarianten mit verringerter Temperaturstabilität? Begründen?

A:

→Glycin Helixbrecher – verringert Stabilität→ verringerte Wirkung 

→Glycin kann keine Wasserstoffbrücken bilden und deswegen weitere Abnahme der Stabilität (fehlender Faktor), außerdem erhöht Glycin aufgrund seiner fehlenden Chiralität die Flexibilität und dies ist bei Proteinen und Temperaturstabilität immer nachteilig 

→bei Temperaturstabilität ist Flexibilität hinderlich, weil man eher rigide Strukturen braucht an denen das Protein nicht auseinander brechen kann 

→wenn man mehr aktive Varianten haben möchte (unabhängig von Temperatur)→ dann wird die Struktur ohne Glycin bevorzugt, weil dann weniger helixbrechende Strukturen eingesetzt werden und damit mehr die für uns notwendige Struktur beibehalten wird

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Q:

Sie entwickeln zwei Zufallsmutagenesemethoden und mutagenisieren separat mit jeder dieser beiden Methoden das gleiche Gen, um die Temperaturstabilität zu erhöhen. Eine Methode generiert an jeder Position im Protein ein Glutamat; die Zweite generiert jeweils ein Alanin. Für welche der beiden Methoden erwarten Sie eine höhere Anzahl an thermostabileren Proteinvarianten? Begründen Sie detailliert Ihre Einschätzung (0 + 3= 3 Punkte).

A:

→Höhere Anzahl an thermostabileren Varianten bei Methode A) mit Glutamat, da dieses Ionische WW und Wasserstoffbrücken eingehen kann, welche das Protein stabilisieren und somit die Flexibilität erniedrigt aber nicht im schlechten Maßstab 

→(für thermostabilere Varianten müssen Ladungssubsitutionen erzeugt werden

→ WW mit AS mit entgegengesetzter Ladung) →Flexibilität erniedrigt für Temperaturstabil→ daher braucht es stabilere und stärkere Bindungen

→ z.B. ionische Wechselwirkungen (zusammen mit positiven AS) Salzbrücken bilden und sollte die Temperaturstabilität erhöhen; Alanin ist neutral und kann keine starken Wechselwirkungen eingehen 

→(negative AS auf der Oberfläche erhöhen Stabilität siehe Subtilitin)

Q:

In einem Gelenkten Evolutionsexperiment finden Sie eine Mutante, die eine höhere Thermostabilität hat. Ein Alanin ist an dieser Position durch ein Cystein ersetzt und biophysikalische Charakterisierungen ergeben, dass die Stabilität durch eine neue Disulfidbrückenbindung erzielt wird. Für die Vielfaltsgenerierung auf DNA-Ebene haben Sie die epPCR Methode verwendet. Wie schätzen Sie die Erfolgsaussichten ein, mittels Sättigungsmutagenese (z.B. QuikChange) an dieser Position noch thermostabilere Varianten aufzufinden? Begründen Sie detailliert Ihre Einschätzung (0 + 2.5 = 2.5 Punkte).

A:


→es kann nur Cystein Disulfidbrücken ausbilden und wenn dies als angesprochener Grund bewertet wird dann kann keine weitere Verbesserung eingeleitet werden

→Disulfidbrücken sind kovalente Bindungen, daher stärker als hydrophobe WW, H Brücken oder ionische Wechselwirkung und deswegen keine weitere Steigung möglich

Q:

Sie wollen die Schmelztemperatur von DNA erniedrigen durch Zugabe eines wassermischbaren Lösungsmittels. Welches würden Sie verwenden, erläutern Sie die Schmelzpunktserniedrigung der doppelsträngigen DNA auf molekularer Ebene (0 + 1 +1= 2.0

A:

→Erlärung muß enthalten: ein Lösungsmittel wie DMSO/THF oder Alkohole (Butanol und höherkettige Alkohole sind nicht mehr ausreichend wassermischbar), die wassermischbar sind und selber H-Brücken bilden können (1 Punkt); letzteres schwächt die H-Brückenbildung zwischen den DNA Strängen und reduziert die Schmelztemperatur (1 Punkt).

→es darf nicht zu hydrophob sein, weil sonst die Funktion nicht mehr gewährleistet ist und die auch die Löslichkeit nicht mehr ausgeprägt ist→ es bietet sich beispielswiese Ethanol, DMSO an und es müssen die H Brücken geschwächt werden, weil diese die Stabilität bestimmt.

Q:

Aus einem Gelenkten Evolutionsexperiment erhalten Sie 10 mutierte Gene (Länge 3000 Basenpaare). Jedes Gen trägt jeweils in einem Codon eine Mutation, die zu einem einzigartigen Aminosäureaustausch führt und die Aktivität des Enzyms um den Faktor zwei verbessert. Sie stellen eine Mischung aus allen 10 mutierten Genen her und führen ein StEP Experiment durch. Um zu sehen, ob die neue Mutantenbibliothek eine hohe Qualität besitzt, picken Sie 20 Klonie von der Agarplatte, isolieren die Plasmide und sequenzieren 20 Gene

ohne vorherigen Aktivitätstest. Sie finden nur die Wildtyp- Sequenz. Woran liegt dies? Erklären Sie letzteres auf molekularer Ebene? (0 + 3 = 3.0 Punkte).

A:

The staggered extension process (also referred to as StEP) is a technique (modified PCR) to create new, mutated genes with qualities of one or more initial genes


Da jedes Gen nur eine Mutation in einem bestimmten Codon enthält, ist das entsprechende Codon in allen anderen Genen unmutiert.

Hybridisierung der Fragmente ist statistisch und da mehr wt-Fragmente vorhanden sind, baut sich am ehesten wt-DNA zusammen -> Exponentielle zunahme der wt-DNA führt zum austitern der Mutation-tragenden Fragmente


→Da jedes Gen nur eine Mutation enthalt sind 9 Gene pro Positionen vorhanden, die keine Mutation aufweisen. Da die Hybridisierung der Fragmente rein statistisch erfolgt (nahzu identische Gene) wird bevorzugt pro Zyklus die Wildtyp-Sequenz ampflifiziert. Da bei der PCR DNA exponentiell vermehrt wird, wird nach bereits 10 Zyklen nahezu ausschließlich die Wild- typ-Sequenz vorhanden sein.

→es wird pro Gen nur eine Mutation enthalten, dh man hat 9mal mehr den Wildtyp und damit bei dieser reduzierten Anzahl an Klonen deutlich höhere Wahrscheinlichkeit für diese Klone

→10 Gene zusammen und dann DNA exponentiell vermehrt und dann fast nur Wildtyp pro 1 Mutation 9 ohne Mutationen (Unterschied durch exponentielle Vermehrung immer mehr), verliert man durch geringen Anteil deswegen fast nur Wildtyp obwohl alles da (alle 10 Mutationen auf ein Gen und dann mit WT und dort dann mischen)


wtf diggi hat er hier geschrieben?

Q:

Sie haben in einem Gelenkten Evolutionsexperiment zur Erhöhung der Enantioselektivität vier Aminosäurepositionen in der Bindungstasche identifiziert. Sie sättigungsmutagenisieren jede Positionen einzeln und nacheinander z.B. in vier aufeinanderfolgenden QuikChange Experimenten (Strategie 1); alternativ mutagensieren Sie alle vier Positionen auf einmal (Strategie 2)? Erwarten Sie für die „selektivste Variante“ einer jeden „Strategie“ die gleiche Aminosäuresequenz an allen vier Positionen aufzufinden oder nicht? Begründen Sie im Detail und auf molekularer Ebene Ihre Einschätzung (0 + 3= 2.0 Punkte).

A:

→(Zusammenspiel der Aminosäuren sehr wichtig, evtl. Verschlechterung bei Veränderung nur einer aber Verbesserung bei Austausch von mehreren)

→Nein. Beim Einfügen einzelnen AS wird die Wechselwirkung von verschiedenen AS untereinander nicht berücksichtigt. Der Austausch von vielen AS gleichzeitig bringt Interaktionen der verschiedenen AS Seitenketten mit sich und zeigt so Aktivitäten, die im anderen Experiment nicht erfasst worden wären.

→cooperative Effects among the close and interacting site chains can be found→ aber nur von Relevanz wenn die Stellen auch nahe beeinander liegen sonst nicht beachtne

→ Multi-site ist besser, Grund sind kooperative Effekte zwischen den engen und interagierenden Ketten, die gefunden werden können. Kooperative Effekte können bessere Ergebnisse liefern als die beste single-substitution an jeder Position.

Q:

Sie haben in einem gelenkten Evolutionsexperiment zur Erhöhung der Thermostabilität zwei Aminosäurepositionen in einem Loop-Bereich identifiziert. An beiden Positionen befindet sich die Aminosäure Alanin. Strategie 1: Sie sättigungsmutagenisieren mittels QuikChange die beiden Positionen einzeln und nacheinander und durchmustern jeweils 1000 Klone. Für die zweite Sättigungsmutagenese verwenden Sie die beste Varainte aus der ersten Runde. Strategie 2: Sie sättigungsmutagenisieren beide Positionen gleichzeitig und durchmustern 2000 Klone.

Erwarten Sie thermostabilere Variante für Strategie 1 oder 2?

A:

→Multi site saturation yields better results due to cooperative effects among the two site chains. For thermostability two charged substitutions with opposite charge have to be generated. Single site saturation likely will not lead to improved thermal resistance since a single charge is insufficient to hold the loop together

→Single-Site-Sättigung führt wahrscheinlich nicht zu einer verbesserten thermischen Beständigkeit, da eine einzelne Ladung unzureichend ist, um die Schleife zusammen zu halten.

Q:

In einem Gelenkten Evolutionsexperiment finden Sie drei Aminosäurepositionen, die die Aktivität signifikant erhöhen und räumlich in der Bindungstasche benachbart liegen. Sie führen zwei Experimente durch: Im ersten Experiment mutieren Sie mittels QuikChange (Sättigungsmutagenese) jede der drei Positionen nacheinander. Im zweiten Experiment sättigungsmutagenisieren Sie alle drei Positionen mittels Quikchange gleichzeitig. Was für ein Ergebnis erwarten Sie: Liefern beide Vorgehensweisen die gleichen Aktivitätsverbesserungen und die gleichen Aminosäuresubstitution an den drei ausgewählten Positionen? Begründen Sie Erwartung (0+2= 2.0 Punkte).

A:

→Beim Einfügen einzelner AS wird die Wechselwirkung von verschiedenen AS untereinander nicht berücksichtigt. Austausch vieler AS gleichzeitig bringt Interaktion der verschiedenen AS Seitenketten mit sich und zeigt so Aktivitäten die im anderen Experiment nicht erfasst worden wären. Es ist wahrscheinlicher, dass die kombinatorischen Aspekte zu einem größeren Erfolg führen (verschiedene Ausgangswege), weil dort die Bindungsstruktur der einzelnen Aspekte beachtet werden kann

→Nein. Beim Einfügen einzelner AS wird die Wechselwirkung von verschiedenen AS untereinander nicht berücksichtigt.

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