Biochemie Physikum an der LMU München

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PCR in der Forensik

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PCR in der Medizin

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Die 3 Schritte des PCR Zyklus? 

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Welche Komponenten benötigt man zur Durchführung einer PCR? 

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Was muss bekannt sein um eine PCR durchführen zu können? 

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Was ist eine PCR? 

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Wer entwickelte die PCR Methode 

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Müssen die Primer ganz genau mit den Randsequenzen übereinstimmen? 

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Kann die Zielsequenz länger sein als die Primer? 

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Wie viele Kopien hat man nach 20 Zyklen? 

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Wie verhält sich die Amplifizierungsrate nach dem 2. Zyklus? 

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Wodurch finden PCR Amplifikationszyklen statt? 

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Biochemie Physikum

PCR in der Forensik
-DNA Profil eines Individuums ausgesprochen charakteristisch, Variationen an bestimmtem Genort entscheiden z. B. über HLA (human leucocyte antigen) Typ eines Menschen. Z. B. werden Organtransplantate abgestoßen wenn die HLA Typen von Spender und Empfänger nicht ausreichend übereinstimmen. 
-Vaterschaftsfragen und Verwandtschaftsbeziehungen
-Bei Überfällen zur Analyse von Blutflecken und Spermaproben
-eine Haarwurzel enthält genügend DNA für eine PCR

Biochemie Physikum

PCR in der Medizin
-mit spezifischen Primern lassen sich Bakterien uns Viren leicht nachweisen, so ist es möglich geringe DNA Mengen des HIV-1 bei Personen aufzuspüren, bei denen noch keine Immunantwort gegen das Pathogen ausgelöst wurde
– Durch PCR können Bazillen der Art Mycobacterium tuberkulosis aufgespührt werden (sonst sehr mühsam)
-bei bestimmten Krebsarten : Früherkennung durch identifizieren von Mutationen in bestimmten Wachstumskontrollgenen (sogenannten ras-Genen) 
-Kontrolle von Chemotherapien : Feststellung des Eliminierungsgrades von Tumorzellen
– Nachweis von Leukämien die auf Unordnung der Chromosomen beruhen

Biochemie Physikum

Die 3 Schritte des PCR Zyklus? 
1. Strangtrennung
Die beiden Stränge des ursprünglichen DNA Moleküls werden getrennt indem man die Lösung für 15 Sekunden auf 95°c erhitzt. 
2. Hybridisierung der Primer
Die Lösung wird schnell auf ca 54°c abgekühlt, so können die Primer mit jeweils einem Strang hybridisieren. Ein Primer hybridisiert mit dem 3’Ende der Zielsequenz auf dem einen Strang, der andere mit dem 3’Ende des komplementären Strangs. Primer in großem Überschuss zugegeben – Rückbildung findet quasi nicht statt. 
3. DNA Synthese
Lösung wird auf 72°c erhitzt = optimale Temperatur für die Tag Polymerase. Ist hitzestabiles Enzym aus Thermus aquaticus, thermophiles Bakterium welches in heißen Quellen lebt. Polymerase verlängert beide Primer in Richtung der Zielsequenz, stets von 5′ zu 3′. Synthese erfolgt an beidem Strängen, geht aber über Zielsequenz hinaus.

Biochemie Physikum

Welche Komponenten benötigt man zur Durchführung einer PCR? 

-Lösung welche Zielsequenz beinhaltet 
-Primerpaar welches mit den flankierenden Sequenzen hybridisiert
-alle 4 Desoxyribonukleosidtriphosphate
-eine hitzestabile DNA Polymerase 

Biochemie Physikum

Was muss bekannt sein um eine PCR durchführen zu können? 
Die flankierenden Sequenzen der Zielsequenz

Biochemie Physikum

Was ist eine PCR? 
Eine Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA Sequenzen

Biochemie Physikum

Wer entwickelte die PCR Methode 
1984 von Kary Mullis

Biochemie Physikum

Müssen die Primer ganz genau mit den Randsequenzen übereinstimmen? 
Nein, Primer die von einem Gen bekannter Sequenz abgeleitet sind, ermöglichen die Suche nach Variationen dieser Sequenz

Biochemie Physikum

Kann die Zielsequenz länger sein als die Primer? 
Ja, sehr viel länger 

Biochemie Physikum

Wie viele Kopien hat man nach 20 Zyklen? 
Eine Million

Biochemie Physikum

Wie verhält sich die Amplifizierungsrate nach dem 2. Zyklus? 
Die folgenden Zyklen repliziern die Zielsequenz nun exponentiell 

Biochemie Physikum

Wodurch finden PCR Amplifikationszyklen statt? 
Änderung der Temperatur des Reaktionsgemisches

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