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Lernmaterialien für Molekularbiologische Methoden an der Leibniz Universität Hannover

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TESTE DEIN WISSEN

Worin müssen Start-und Stop Codon immer sein?

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TESTE DEIN WISSEN

Exon

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TESTE DEIN WISSEN

Wie steht es um die Wasserstoffbrückenbindungen in der DNA?

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TESTE DEIN WISSEN

AT - 2fachbindung

GC - 3fachbindung

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TESTE DEIN WISSEN

Mit dem Gehalt der GC-Bindungen steigt/sinkt die Schmelztemperatur?

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TESTE DEIN WISSEN

steigt

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TESTE DEIN WISSEN

Nukleotid

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TESTE DEIN WISSEN
  • AMP
  • CMP
  • UMP
  • dTMP
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TESTE DEIN WISSEN

Was macht die Quartärstruktur?

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TESTE DEIN WISSEN

Interaktion zwischen Peptiden

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Purin paart immer ein

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TESTE DEIN WISSEN

Pyrimidin

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TESTE DEIN WISSEN

Aufbau der DNA

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TESTE DEIN WISSEN
  • Purin paart Pyrimidin
  • Cytosin - Guanin

-> drei Wasserstoffbrücken

  • Adenosin - Thymin

-> zwei Wasserstoffbrücken

  • 5' - Phosphat
  • 3' OH
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TESTE DEIN WISSEN

Codon Usage

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TESTE DEIN WISSEN
  • Codons werden von unterschiedlichen Organismen unterschiedlich häufig genutzt

-> je weniger verwandt die Organismen, desto größer die Unterschiede

-> Ursache: t-RNAs mit verschiedenen Anticodons für gleiche AS unterschiedlich häufig

-> Im heterologen Expressionssystem: Tanslationsabbruch möglich


  • Es gibt Ausnahmen von genetischen Code
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TESTE DEIN WISSEN

Prinzipien biologischer Systeme

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TESTE DEIN WISSEN
  • Alle biologischen Systeme sind hierarchisch strukturiert
  • Es besteht eine sehr enge Verknüpfung zwischen der Struktur und der Funktion
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TESTE DEIN WISSEN

Template Strang

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TESTE DEIN WISSEN

= codogener Strang = antisense Strang = - Strang 

- 3' -> 5' 

- dient als Matrize

-> mRNA wird von 5' nach 3' synthetisiert

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TESTE DEIN WISSEN

Codierender Strang

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TESTE DEIN WISSEN

= Sense Strang = + Strang

- 5' -> 3'

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TESTE DEIN WISSEN

Nukleoside

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TESTE DEIN WISSEN
  • Adenosin
  • Cytidin
  • Guanosin
  • Uridin
  • Desoxythymidin
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Beispielhafte Karteikarten für deinen Molekularbiologische Methoden Kurs an der Leibniz Universität Hannover - von Kommilitonen auf StudySmarter erstellt!

Q:

Worin müssen Start-und Stop Codon immer sein?

A:

Exon

Q:

Wie steht es um die Wasserstoffbrückenbindungen in der DNA?

A:

AT - 2fachbindung

GC - 3fachbindung

Q:

Mit dem Gehalt der GC-Bindungen steigt/sinkt die Schmelztemperatur?

A:

steigt

Q:

Nukleotid

A:
  • AMP
  • CMP
  • UMP
  • dTMP
Q:

Was macht die Quartärstruktur?

A:

Interaktion zwischen Peptiden

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Q:

Purin paart immer ein

A:

Pyrimidin

Q:

Aufbau der DNA

A:
  • Purin paart Pyrimidin
  • Cytosin - Guanin

-> drei Wasserstoffbrücken

  • Adenosin - Thymin

-> zwei Wasserstoffbrücken

  • 5' - Phosphat
  • 3' OH
Q:

Codon Usage

A:
  • Codons werden von unterschiedlichen Organismen unterschiedlich häufig genutzt

-> je weniger verwandt die Organismen, desto größer die Unterschiede

-> Ursache: t-RNAs mit verschiedenen Anticodons für gleiche AS unterschiedlich häufig

-> Im heterologen Expressionssystem: Tanslationsabbruch möglich


  • Es gibt Ausnahmen von genetischen Code
Q:

Prinzipien biologischer Systeme

A:
  • Alle biologischen Systeme sind hierarchisch strukturiert
  • Es besteht eine sehr enge Verknüpfung zwischen der Struktur und der Funktion
Q:

Template Strang

A:

= codogener Strang = antisense Strang = - Strang 

- 3' -> 5' 

- dient als Matrize

-> mRNA wird von 5' nach 3' synthetisiert

Q:

Codierender Strang

A:

= Sense Strang = + Strang

- 5' -> 3'

Q:

Nukleoside

A:
  • Adenosin
  • Cytidin
  • Guanosin
  • Uridin
  • Desoxythymidin
Molekularbiologische Methoden

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Eine der Molekularbiologische Methoden Zusammenfassungen auf StudySmarter | Leibniz Universität Hannover

DNA-Aufreinigung


1. Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff und pulverisieren (bei Gewebe) 


2. Aufschluss der Zellen/Gewebe, dabei Inaktivierung von Proteinen

Art der Homogenisation hängt ab von:

Art des Probenmaterials  Der zu isolierenden Probenmenge     Probenzahl

- Zellwand                            - Milligramm oder Kilogramm            

- Fasern                                                                                                                      

- Gehalt Sekundärstoffe 


Gängige Pufferkomponenten

                                                                                       


SDS

Zerstörung der Plasmamembran


EDTA

reduziert Aktivität von DNasen


DTT/ß-Mercaptoethanol

schaffen reduzierende Umgebung -> beugen oxidativen Schädigungen der DNA während Homogenisation vor


Proteinase K

baut Proteine sehr effizient ab

Vorteil: bei 65° noch aktiv


GTC

chaotropes Salz

denaturiert Proteine, auch DNasen und RNasen, und lysiert gleichzeitig die Zellen


CTAB

sorgt für Entfernung von Polysacchariden (reichhaltig in Pflanzen)

effizientes Mittel, um Proteine zu denaturieren

Hohe Ionenstärke: Bildet Komplex mit Proteinen und neutralen Polysacchariden, DNA bleibt in Lösung

Niedrige Ionenstärke: Fällt Nukleinsäuren und saure Polysaccharide


PVP

Akzeptor für reaktive, oxidierte Polyphenole


3. Abtrennung der Nukleinsäuren von anderen Zellbestandteilen

Nach dem Aufschluss und der Inaktivierung der Nukleasen erfolgt meist eine Zentrifugation bei 4°C, bei der die Nukleinsäuren im Überstand von Zelltrümmern und Fasern abgetrennt werden.

DNA befindet sich nun mit Proteinen, Lipiden, etc. im Überstand.


Phenolextraktion ( "PCI")

25 Teile Phenol (basisches Phenol für DNA Aufreinigung, saures Phenol für RNA Aufreinigung)

24 Teile Chloroform

1 Teil Isoamylalkohol (Schaumhemmer)

  • Phenol und Wasser bilden zwei nicht mischbare Phasen aus - die organische Phenolphase befindet            sich unten.
  • Chloroform stabilisiert zusätzlich die Phasengrenze.
  • Durch Phenol/Chloroform werden Proteine irreversibel denaturiert → fallen an der Phasengrenze aus
  • DNA löst sich aufgrund ihres negativ geladenen Rückgrats nicht in der organischen Phase                             → verbleibt in der oberen, wässrigen Phase


PCI-Mischung wird der DNA Lösung im Überschuss zugegeben

DNA und RNA: obere wässrige Phase

Proteine: denaturiert auf unterer organischen Phase

Lipide: gelöst in Organischer Phase

Funktion:     - Aufreinigung der DNA

                      - Reduktion des Volumens, in dem die DNA gelöst ist (Konzentration)


 



4. Trennung von RNA und DNA

Erfolgt durch Enzyme: 

DNase freie RNase um DNA aufzureinigen

RNase freie DNase um RNA aufzureinigen


5. Konzentrierung und Umpuffern 


Ethanolfällung:

3 Effekte

- unerwünschte Stoffe in der DNA-Lösung werden entfernt

- DNA wird konzentriert

- sedimentierte DNA kann auf diese Weise in einen neuen Puffer überführt werden


  • Ethanol entzieht der DNA die Hydrathülle → die nun exponierten negativ geladenen
  • Phosphatgruppen bilden mit Gegenionen wie Na+ ein Salz
                → Ethanolfällung kann nur funktionieren, wen genug Kationen vorhanden sind, die an die                                               negativ geladenen Phosphatgruppen binden können


  1. DNA-Lösung + Salz (z.B. Natriumacetat) → Hinzugabe des doppelten Volumens Ethanol (-20°C) → mischen 
  2. Vortexen und länger als 10 Minuten auf Eis stellen (DNA fällt aus)
  3. Zentrifugieren (Überstand verwerfen)
  4. Zugabe von 70 % Ethanol zum Pellet (höhere Konzentrationen können DNA irreversibel schädigen) Pellet = ausgefallene        DNA
  5. Zentrifugieren (Überstand verwerfen)
  6. Zugabe des neuen Puffers (z.B. TE-Puffer)
  7. Restliches Ethanol abdampfen


oder


Isopropanolfällung:

  • Alternative zur Ethanolfällung
  • Wird in finaler Konzentration von 40-50 % zugesetzt
  • Fällungsprinzip = Ethanolfällung
  • Vorteil: geringere Volumen benötigt
  • Nachteil: nicht so effizient


Verwendete Salze und ihre Eigenschaften

SalzStammlösungArbeitslösungBemerkung
Ammoniumacetat10 M 2-2,5 MHäufig verwendet,
dNTPs und Oligonukleotide werden abgetrennt;
Gut geeignet nach ß-Agarase-Abbau von Gelen;
Sollte vermieden werden, wenn nachfolgend T4 Polynukleotidkinase eingesetzt wird
Lithiumchlorid8 M0,8 MFür Fällung von RNA > 300 Basen,
dsDNA wird nicht gefällt
Natriumchlorid5 M0,2 MWenn SDS verwendet wird → SDS verbleibt im Überstand
Natriumacetat3 M (pH 5,2)0,3 MSehr häufig für DNA und RNA verwendet,
universell einsetzbar



Silica Matrices ("Kits")

Zentrale Komponente: Silicasäulchen, -membranen, oder -kügelchen


  • DNA wird in Gegenwart hoher Konzentrationen chaotroper Salze an Siliciumoxid gebunden
  • Chaotrope Salze entfernen Hydrathülle von Biomolekülen
          → erlaubt positiv geladenen Ionen, eine Salzbrücke zwischen negativ geladenem Silica und negativ                 geladenem Phosphatrückgrat der DNA herzustellen
  • Kleine Nukleinsäuren und Proteine werden leicht ausgewaschen (Proteine werden denaturiert)
         → binden nur schwach an die Matrix
  • Niedrige Salzkonzentration führt zum Auswaschen chaotroper Salze
         → Silika wird wieder negativ geladen, DNA wird eluiert (geht nur im basischen Milieu!)

 

Unterschiede in verschiedenen Kits

- Beschaffenheit der Silica-Matrix

- Kapazität

- Adsorptionsstärke

- verwendete chaotrope Ionen


Funktioniert nur im basischen. Kein Reinstwasser, da zu sauer!

 

Das Prinzip von Silica-basierten Aufreinigungsverfahren beruht auf der Bindung der DNA an eine Silica-Matrix in Gegenwart von chaotropen Salzen (A und A1). Die Proteine und kleine Nukleinsäuren bis zu einer Länge von ca. 70 bp binden nicht und werden mit Ethanol und Salz ausgewaschen (B). H2O oder TE-Puffer (C) stellen die Hydrathülle der DNA wieder her, sie wird eluiert (C1).

Tipps zum Umgang mit Kits

- möglichst wenig Elutionspuffer 

- Enthält Elutionspuffer EDTA? → Obacht bei folgenden Enzymreaktionen

- nicht mit H2O eluieren, sondern niedrig konzentriertem Tris-Puffer (pH > 7)

- nach Silika-Säule keine OD-Bestimmung → keine Photometermessung sondern Gel

- Nie Komponenten aus verschiedenen Kits zusammen verwenden


Plasmidpräperation aus E. coli 

  1. Anzucht bei 37°C bis zu einer OD600 von ungefähr 0,8 → zügig messen, da Bakterien zu Boden sinken
  2. 15 Minuten auf Eis Zellteilung stoppen, alle Bakterienzellen befinden sich so in einem einheitlichem Stadium
  3. Pelletieren durch Zentrifugation
  4. Isolation der Plasmid DNA nacheinander werden drei Lösungen hinzugegeben

                Lösung I: Tris, EDTA + RNase (TE-Puffer); Waschen der Bakterien, Medium auswaschen (Substanzen die Stören)

                 Lösung II: SDS, NaOH (Lauge, denaturiert Proteine); Lysis und Stränge gehen auseinander

                   

Hiernach nur Kippen, nicht Vortexen! Da sonst die schon recht kaputten Bakterienzellen zerreißen und gDNA nach Draußen treten könnte

         

                 Lösung III: Na-Acetat; für neutralen pH, Plasmide renaturieren, Reste der Zellwand halten gDNA                                                                                    drinnen, gDNA drinnen und Plasmid-DNA draußen

           5. Zentrifugieren   alles Pelletieren, Plasmid-DNA im Überstand


Der Überstand mit den Plasmiden wird vorsichtig in ein neues Gefäß überführt und es wird eine klassische Ethanolfällung durchgeführt


Gegenspieler erfolgreicher Nukleinsäure-Extraktionen

Molekularbiologische Methoden

Diese Zusammenfassung wurde von Kommilitonen erstellt

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