LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden an der Karlsruher Institut für Technologie

Karteikarten und Zusammenfassungen für LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden an der Karlsruher Institut für Technologie

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Was sind immunologische Methoden?

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Wovon sind Spezifität/Avidität/Affinität eines Antikörpers abhängig?

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Was sind mono-/polyklonale Antikörper?

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Was sind RIA?

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Vor- und Nachteile eines Radioimmunoassays?

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Puffersysteme für die Elektrophorese?

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Was ist PCR?

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Was ist ein Template? Wie erhält man es?

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Glutamin in Zellkulturmedien?

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Vor- und Nachbereitung von sterilem Arbeiten?

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Mediumwechsel bei Zellkulturen: warum, wann und Protokoll?

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Passagieren/Subkultivieren bei Zellkulturen: wann, warum und Protokoll?

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LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was sind immunologische Methoden?
- beruhen auf Einsatz von Antikörpern  und den von ihnen vermittelten Reaktionen (Antigen-Antikörper-Komplexe)

Einsatzgebiete:
- Immunopräzipitation (2D-Immundiffusion nach Ouchterlony)
- Immuniassays (ELISA, RIA)
- Immunoblotting
- immunoelektrophoretische Methoden

Vorteile:
- hohe Spezifität
- viele Einsatzmöglichkeiten

Nachteile:
- komplexe Gewinnung (teuer!)
- teilweise komplizierte Handhabung

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Wovon sind Spezifität/Avidität/Affinität eines Antikörpers abhängig?
- Spezifität eines Antikörpers ist abhängig von der Bindungsstärke (Avidität) zum Antigen
Avidität ist u.a. Abhängig von der Affinität 
-  Affinität ist abhängig von der Bindungsstärke aller suballele (?)
homologe Antigene (verwendete Immunogene) besitzen stärkste Affinität, idR geringere Affinität haben kreuzreagierende Antigene (heterologe Antigene), die mit den Immunogenen nicht identisch, sondern nur chemisch verwandt sind

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Was sind mono-/polyklonale Antikörper?
Gewinnung von Antisera durch Immunisierung von Kaninchen mit Proteinpräparaten oder synthetischen Peptiden (auf Träger)

->
polyklonale Antikörper:
- Antikörper gegen ein Antigen, die viele verschiedene Isotypen mit unterschiedlicher Affinität zu verschiedenen Epitopen repräsentieren
- werden von vielen Zellklonen gebildet

monoklonale Antikörper:
- Antikörper chemisch einheitlicher Struktur, die mit nur einem Epitop auf dem Antigen reagieren
- Gewinnung durch immortalisierte, isolierte B-Zellen
- Rekombinante Gewinnung von Antikörper-Fragmenten

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was sind RIA?
Radioimmunoassays
- Immunreaktion mit anschließender Messung der Radioaktivität
- RIA in Lösung vs Festphasen-RIA
- beide Varianten werden als kompetitiver Assay durchgeführt:
+ radiomarkierte (“heiße“) Antigene konkurrieren mit unmarkierten (“kalten“) Antigenen
+ Radiomarkierung durch einführen von 125I oder 3H 
+ Messung der Radioaktivität mithilfe eines Szintillationsdetektors

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Vor- und Nachteile eines Radioimmunoassays?
Vorteile:
- sehr empfindlich, Antigene im Bereich von 0,5 pg/ml können bestimmt werden
-> Hauptanwendungsgebiet bei LM war/ ist Nachweis von Hormonen und Tierarzneimitteln 

Nachteile:
- stark begrenzte Lagerungsfähigkeit der heißen Antigene durch Halbwertszeit der Nucleotide 
- geeignete, den Auflagen für den Umgang mit radioaktivem Material entsprechende, Laboreinrichtung nötig
- Kosten für Schutz des Personals
- Beseitigung radioaktiven Abfalls
...

-> RIA wurde weitgehend von Enzymimmunoassays (ELISA) verdrängt 

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Puffersysteme für die Elektrophorese?
- je nach Trennprinzip/Methode unterschiedlich bezüglich:
+ pH
+ Ionenstärke 
+ Pufferkomponenten
+ Zusatz denaturierender Agenzien

- häufig verwendet:
+ Tris-HCl oder Tris-Glycin bei pH-Werten von ca. 7-9
+ für bestimmte Anwendungen: Tris-Barbiturat oder Tris-Tricin
+ für basische Proteine: zb Glycinacetat bei pH = 3,1 -> Proteine laufen in Richtung Kathode!

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was ist PCR?
Polymerase Chain Reaction:
-> in vitro Reproduktion von DNA-Segmenten 
- Amplifikation von DNA-Segmenten
- 1987 erstmals beschrieben von Kary B. Mullis
- kein Nachweisverfahren an sich, wird in unterschiedliche Nachweismethoden und Verfahrensabläufe integriert
- wichtige Schritte vor der PCR sind zb Nucleinsäureisolierung und Abtrennung möglicher PCR-Inhibitoren 
- Nach der PCR: zb Elektrophorese, Hybridisierung etc. gekoppelt mit qualitativen oder quantitativen Nachweisverfahren statt

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was ist ein Template? Wie erhält man es?
- ist immer DNA (genomische DNA, Plasmide, virale DNA)
- bei Untersuchung von RNA zuvor Umschreibung in cDNA (copy DNA) mittels “Reverser Transkriptase“ (RT-PCR)
- Probenaufarbeitung:
+ Isolierung der DNA aus biologischem Material
+ Abtrennung von störenden Bestandteilen wie Proteinen, Fetten und Inhibitoren (zB Hämoglobin-Abbauprodukte in Blut)
+ Bestimmung von DNA-Gehalt und Reinheit

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Glutamin in Zellkulturmedien?
- in höheren Konzentrationen (2-4 mM) verwendet
- Aminosäure und Energiequelle
- Endprodukt des Glutaminstoffwechsels ist Ammoniak
- instabil in wässrigen Lösungen
- Ersatz: glutaminhaltige Dipeptide 
-> werden durch intrazelluläre Peptidasen gespalten (stabiles “Depot“)
-> nicht für alle Zellen geeignet, da sie zu Wachstumsverzögerungen führen können 

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Vor- und Nachbereitung von sterilem Arbeiten?
- Fenster und Türen des Labors müssen geschlossen sein
- vor und nach der Arbeit Hände waschen und reinigen (zb Sterilum)
- Laborkittel und Handschuhe tragen
- Arbeitsplatz (Sterilwerkbank) vor und nach der Arbeit mit 80% EtOH reinigen
- benötigte Materialien ebenfalls mit 80% EtOH reinigen und unter die Sterilwerkbank stellen
-> dort nur Geräte und Zubehör, die unmittelbar gebraucht werden!

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Mediumwechsel bei Zellkulturen: warum, wann und Protokoll?
Warum?
- Verbrauch der Nährstoffe
- Stoffwechselendprodukte 
- Halbwertszeit von Antibiotika

Wann? 
- 1-2 mal/Woche
- 24 h - 48h nach Präparation bzw. Auftauen

Protokoll:
1. Kulturmedium (37°C) im Wasserbad vorwärmen 
2. Kulturen aus Inkubator nehmen und unter die Werkbank stellen
3. Kompletter Mediumwechsel, evtl waschen (insbesondere nach Auftauen/Präparation) 

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Passagieren/Subkultivieren bei Zellkulturen: wann, warum und Protokoll?
“Passagieren“ der Zellen:
- Zellen werden durch “Trypsinierung“ aus dem Monolayer herausgelöst, in Suspension gebracht und  nach entsprechenden Verdünnungen in ein neues Kulturgefäß überführt
- Anzahl der Subkultivierung und damit der Passagenzahl der Kultur erhöht sich um 1

Warum?
- 16-24h Verdopplungszeit für die meisten Linien
- Zellkulturgefäß nach 2-3 Tagen dicht bewachsen
-> Wachstumsstopp/ablösen und Zelltod 

Wann?
- 1-2 mal/Woche

Protokoll:
1. Zellen aus Brutschrank entnehmen
2. Medium absaugen
3. Waschen mit warmer, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca2+, Mg2+ 
4. Trypsin-EDTA-lösung zugeben (Pankreasprotease)
5. Zellen bei 37°C für 3-10 Minuten inkubieren
6. Zugabe von Medium mit FKS (enthält Proteaseinhibitoren)
7. Entsprechende Menge der Zellsuspension in neues Kulturgefäß überführen, ggf Zellzählung 


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