Gentechnik an der Karlsruher Institut für Technologie

Karteikarten und Zusammenfassungen für Gentechnik an der Karlsruher Institut für Technologie

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Befürchtung bei horizontalem Gentransfer?

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Konjugation?

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Transduktion?

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Horizontaler Gentransfer?

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Potentielle Risiken für den Menschen?

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Nachweis der Zielsequenz mittels PCR?

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Nachweis des Phänotyps von GVOs?

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Strategien zum Nachweis einer genetischen Veränderung bei GVOs?

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Beispiel für “mitgelieferte“ Nachweismethode?

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Unterlagen über Zulassung von GVOs?

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Anforderungen an die Analytik von GVOs? Was muss nachgewiesen werden können?

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Positive Selektion transgener Pflanzen?

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Gentechnik

Befürchtung bei horizontalem Gentransfer?

Transfer von Antibiotikaresistenzen der transgenen Pflanze auf zb pathogene Bakterien

– resistente MOs sind schon Problem (zb Massentierhaltung)
– zb Gentamicin Ist Notfallantibiotikum (zB gegen multiresistente Tuberkulosebakterien, Nebenwirkungen), wird/wurde auch häufig als Resistenzmarker verwendet

Aber: Risiko horizontalen Gentransfers von transgenen Pflanzen auf Bakterien extrem gering (2×10^-17)
Neue Techniken machen Einbau von Antibiotikaresistenzen als Marker entbehrlich -> konventionell eher Ausnahme

Gentechnik

Konjugation?

– Art des horizontalen Gentransfers
– F-Faktor: Fähigkeit, genetisches Material auf andere Bakterien zu übertragen
– F-Plasmide des Donors regulieren Synthese von Pili, die Kontakt mit Empfängerzelle initiieren
– Porenbildung (wahrscheinlich kurze Verschmelzung der Zellwände, DNA-Transfer als Einzelstrang,

– bei HfR-Stämmen (high frequency of integration) Integration im Empfängergenom via homologe Rekombination -> von HfR Zelle “infizierte“ Zelle wird nicht F+, erhält aber auch Bakterien-DNA
Aber: “Rückbildung“ des Plasmids möglich -> Bakterien-DNA kann mitgenommen werden (F‘)
– sonst: Zelle wird F+ durch Integration des Plasmids

Gentechnik

Transduktion?

– Art des horizontalen Gentransfers
– Transport von Fremd-DNA zum Empfänger durch Bakteriophagen: bei Phagenvermehrung kann es passieren, dass in einen Phagen ein Stück Bakterien-DNA statt Phagen-DNA eingebaut wird, die dann bei der Infektion einer anderen Zelle in deren Genom eingebaut wird
-> Genübertragung ohne Kontakt der Bakterien miteinander
-> ca 1 von 10.000 Phagen trägt Wirts-DNA

Gentechnik

Horizontaler Gentransfer?

= lateraler Gentransfer, nicht sexuell von einem bestehenden Organismus auf einen anderen bereits bestehenden Organismus Unabhängig von Artgrenzen

3 Möglichkeiten bei Prokaryoten:
– Transduktion (Bakteriophagen)
– Konjugation (F+)
– Transformation (Zufall, tote DNA)

Horizontaler Gentransfer ist Sehr selten​ Unter natürlichen Bedingungen praktisch vernachlässigbar​​​

Gentechnik

Potentielle Risiken für den Menschen?

– horizontaler Gentransfer
– Allergien
– pleiotropher Effekt: unerwartete/unerwünschte Eigenschaften durch Einbau des Genkonstrukts in das Genom an vorher nicht bestimmbarer Stelle

Gentechnik

Nachweis der Zielsequenz mittels PCR?

1. Qualitative PCR (Endpunkt PCR)
2. Nachweis und Quantifizierung mittels real-time-PCR

Ermöglichung des Nachweises in erhitzten/anderweitig prozessierten LM:  Fragmentgröße der Zielsequenzen wird möglichst gering gewählt: idR deutlich unter 200 bp, im Idealfall zwischen 60 und 150 bp

Qualitativ:
Zb Roundup-ready-Soja:
-Roundup-ready-soja-spezifischer Primer -> Detektion eines Amplifikats mit 172 bp
– Soja-spezifischer Primer -> Detektion eines Amplifikats mit 118 bp -> Amplifikationskontrolle

Quantitativ (real time PCR)
Untersuchung auf RRS (roundup ready soja)
– Untersuchung in zwei parallelen PCR-Ansätzen
– in PCR1: amplifizieren/messen der Spezies-spezifischen Soja-Lectin-Sequenz (als Referenz​)​​​
– in PCR2: amplifizieren/messen der RRS-Sequenz
– mittels DNA aus Referenzstandard (zb 5% RRS) wird je eine Kalibrierung (Standardreihe, Verdünnung) aufgestellt
-> Auftragung Kopienanzahl (entsprechend errechnet) gegen Ct (treshold cycle = Anfang des exponentiellen Wachstums)

-> % RRS aus Kopien (RRS)/ Kopien (Lectin)

Gentechnik

Nachweis des Phänotyps von GVOs?

-> Nachweis der durch die genetische Veränderung bewirkten neuen Eigenschaften/Inhaltsstoffe

– häufig Nachweis der gebildeten Proteine (zb CP4 EPSPS (Enol-Pyruvyl-shikimat-3-phosphat-Synthase), PAT (Phosphinotricin-Acetyltransferase), cry (Kristalloproteine)

-> Immunoassays
Erfordern spezifische monoklonale Antikörper, zB
– ELISA (Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay)
– Kapillardiffusionstest: Streifen-Schnelltest

Gentechnik

Strategien zum Nachweis einer genetischen Veränderung bei GVOs?

1. Nachweis des Phänotyps
2. Nachweis des Genotyps

Gentechnik

Beispiel für “mitgelieferte“ Nachweismethode?

Roundup Ready Soja:

Generell: Southern blot und PCR möglich zur Detektion der Gensequenzen auf den Plasmiden

– ELISAs zur Detektion der CP4 EPSPS -Proteine in Pflanzen (zB als Kapillardiffusionstest)

– Patentspezifisches assay basierend auf real-time PCR wurde dem Joint Research Center zur Verfügung gestellt (Community Reference Laboratory CRL)
-> online einsehbar (Website des JRC)

Zertifiziertes Referenzmaterial kann über American oil chemists society ​ bezogen werden​​​​​​

Gentechnik

Unterlagen über Zulassung von GVOs?

– öffentlich verfügbar
– Anträge, Zulassung einsehbar
– Transformationsmethode, Ursprung der DNA? Welche genetischen Elemente befinden sich auf dem eingeschleusten Plasmid-Vektor?

Bedingung für Zulassung ist immer:
Nachweismethode (standardisiert) wird mitgeliefert

Gentechnik

Anforderungen an die Analytik von GVOs? Was muss nachgewiesen werden können?

1. Nachweis von zugelassenen GVOs
– in nicht/niedrig prozessierten LM
– in hoch prozessierten LM

2. Nachweis von nicht zugelassenen GVOs

3. Nachweis von GVOs über 0,9% ​(= Kontaminationen über​​​​​​ Schwellenwert)

Gentechnik

Positive Selektion transgener Pflanzen?

Zb über einfügen von
– β- Glucoronidase:
Selektion über Hydrolyse von Benzyladenin-Glucoronid zum aktiven Cytokinin Benzyladenin
-> wird für Entwicklung zur vollständigen Pflanze benötigt

– Phosphomannoseisomerase: Mannose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat -> Abbau
-> ohne ist Abbau unmöglich

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