Cell Culture Technique an der Hochschule Biberach | Karteikarten & Zusammenfassungen

Lernmaterialien für Cell Culture Technique an der Hochschule Biberach

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TESTE DEIN WISSEN

What impact do contaminants have on clinical trials and production?

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TESTE DEIN WISSEN
  1. Vollständige Zerstörung der Zellkultur im schlimmsten Fall
  2. Auswirkungen auf zellabgeleitete Produkte, z. B. Ausbeute, Stabilität
  3. Beeinträchtigung der Sicherheit von zellbasierten therapeutischen Produkten
  4. Kontamination anderer Kulturen, die zur gleichen Zeit im Labor gehandhabt werden
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Unterschiede zwischen adhärenten und Suspensionszellen in Bezug auf Kultivierung, Passaging und Wachstum?

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Adhärente Zellen 

  • Kultivierung: Wachsen & prolieferieren auf der Oberfläche des Kulturgefässes 
  • Wachstum: Wachsen als Monolayer bis die Zellkontakt-Hemmung statt findet (Konfluenz) und die Zellen sterben
    • Wachstum ist auf die Oberfläche des Kulturgefäss begrenzt  
    • Scale-up: Rollerflaschen wurden dazu verwendet, um die Wachstumsoberfläche zu vergrößern 
    • Um die Zellen in der log-Phase zu halten werden die Zellen regelmäßig passagiert
  • Passaging: Aufteilen der Zellen in mehrere Aliquots und dem Überführen der Tochterzellen in ein neues Kulturgefäß. 
    • Adhärente Zellen: Trypsin (Matrix-Zelle,Hydrolyse C-terminus von Lys und Arginin) und EDTA (Zell-Zell-Verbindungen, Chelatbildung mit Mg und Ca) 


Suspensionszellen

  • Kultivierung: Wachsen & profilieren in einem flüssigen Kulturmedium ohne an die Oberfläche des Kulturgefässes zu binden. 
  • Wachstum
    • in CO2 Inkubatoren 
    • Scale-up: Spinner-Flaschen oder Schüttelkolben 
    • Medium muss ständig gemischt werden, z.B. Rühren 
    • Konzentration der Nährstoffe im Medium begrenzen das Wachstum der Zellen 
    • Über die Zeit sinkt die Konzentration von Wachstumsfaktoren und Mediumkomponenten 
  • Passaging: Eine kleine Menge der Mutterkultur wird entnommen und mit neuem frischen Medium versetzt
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Two reasons for the change of pH during fermentation and pH regulation 

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  1. A change in pH can be due to a contamination 
    • Bacteria: pH sudden drops 
    • Yeast & molds: remains stable at the beginning, increases rapidly with the developing infection 
  2. Accumulation of toxic by-products like lactic acids or ammonia can change the pH 
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How can the pH be regulated during the fermentation? 

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The pH can be influenced by: 

  1. Adding base 
  2. Using buffering system: CO2-bicarbonate based buffer: 
    • CO2-concnetration in the gas phase 
    • CO2 + H2O < => H2CO3 < => H+ + HCO3 – in the liquid phase
    • Balance between dissolved CO2 and Bicarbonate HCO3 changes in atmospheric CO2, alter the pH in the medium 
    • it is necessary to use exogenous CO2 (4-10%) 
    • Escape of carbon dioxide from the medium leads to an increase in OH-concentration (raise the pH) 


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Which three proteins are necessary for attachement and where do they come from? 

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  1. Glycoproteins (received by the serum) 
  2. Conditioning factors (secreted by the cells themselves) 
  3. Cell surface glycoproteins (from the surface of the cell) 
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Which two sources of nutritients for cells were used? 

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Glucose: Glycolysis takes place under anaerobic and aerobic conditions. In this process glucose is degraded to pyruvate. Lactate is the end product of anaerobic glycolysis 


Glutamine: Glutamine -> Glutamate -> Alpha-Ketoglutarate (part of the citrate cycle), which is part of the energy generation of cells (is upregulated in cancer cells) 

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Nenne Methoden der Zellauftrennung nach der Selektion mit Antibiotika für adhärente Zellen  

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  1. Klonierungszylinder 
  2. Wattestäbchen 
  3. Einzelzellverdünnung 
  4. Scraper 
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Two terms for conversion from finite to infinite cells 

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  1. Transformation 
  2. Immortalization
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Cryopreservation: What is added? What must be considered in terms of temperature and time during freezing? What does DMSO do? 

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Cryopreservatice Medium: 

  • FCS (Fatal calf serum): Protein source 
  • DMSO (Dimethyl Sulfoxide): Cryoprotectant, that prevents intracellular/extracellular crystals from forming in cells during freezing process (cause cell death) 
  • DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium)

Temperature:

  • Eukaryotic cells can be stored at temperatures below -130 °C for long periods (decades) 
    • Stored in the N2-gas phase at temperatures between -130 and -150 °C
    • Or in liquid nitrogen at -196 °C or in special refrigerators.
  • To low temperatures can cause a decrease of cell viability. 
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What must be considered during cryopreservation? 

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  1. The cells are frozen slowly (if cells are frozen to quickly ice crystals can form causing membrane damage and cell death) 
  2. Should be checked for contamination
  3. Count the number of viable cells (cells should be in log phase) (more than 90% viability, that they can used, because a lot of cells will die because the whole process is really stressful)
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What are the secondary metabolites of the glutaminolysis and glycolysis? What are the effects of lactate and ammonium accumulation on cell culture? 

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Gycolysis: Lactate 

Glutaminolysis: Ammonia 


Accumulation of these products may limit cell division and decrease the product manufacture and product quality.

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Bewerte die Ergebnisse einer Zellzählung hinsichtlich der Genauigkeit und der Zuverlässigkeit
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The accuracy of the evalutation with the neubauer counting chamber always depends on the handling and the homogeneity of the sample 

-> If the sample is not properly homogenized, the result may be strongly falsified 

-> In addition, the number of cells counted is often subjective, as it is not always possible to say exactly what is a dead cell and what not 


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Q:

What impact do contaminants have on clinical trials and production?

A:
  1. Vollständige Zerstörung der Zellkultur im schlimmsten Fall
  2. Auswirkungen auf zellabgeleitete Produkte, z. B. Ausbeute, Stabilität
  3. Beeinträchtigung der Sicherheit von zellbasierten therapeutischen Produkten
  4. Kontamination anderer Kulturen, die zur gleichen Zeit im Labor gehandhabt werden
Q:

Unterschiede zwischen adhärenten und Suspensionszellen in Bezug auf Kultivierung, Passaging und Wachstum?

A:

Adhärente Zellen 

  • Kultivierung: Wachsen & prolieferieren auf der Oberfläche des Kulturgefässes 
  • Wachstum: Wachsen als Monolayer bis die Zellkontakt-Hemmung statt findet (Konfluenz) und die Zellen sterben
    • Wachstum ist auf die Oberfläche des Kulturgefäss begrenzt  
    • Scale-up: Rollerflaschen wurden dazu verwendet, um die Wachstumsoberfläche zu vergrößern 
    • Um die Zellen in der log-Phase zu halten werden die Zellen regelmäßig passagiert
  • Passaging: Aufteilen der Zellen in mehrere Aliquots und dem Überführen der Tochterzellen in ein neues Kulturgefäß. 
    • Adhärente Zellen: Trypsin (Matrix-Zelle,Hydrolyse C-terminus von Lys und Arginin) und EDTA (Zell-Zell-Verbindungen, Chelatbildung mit Mg und Ca) 


Suspensionszellen

  • Kultivierung: Wachsen & profilieren in einem flüssigen Kulturmedium ohne an die Oberfläche des Kulturgefässes zu binden. 
  • Wachstum
    • in CO2 Inkubatoren 
    • Scale-up: Spinner-Flaschen oder Schüttelkolben 
    • Medium muss ständig gemischt werden, z.B. Rühren 
    • Konzentration der Nährstoffe im Medium begrenzen das Wachstum der Zellen 
    • Über die Zeit sinkt die Konzentration von Wachstumsfaktoren und Mediumkomponenten 
  • Passaging: Eine kleine Menge der Mutterkultur wird entnommen und mit neuem frischen Medium versetzt
Q:

Two reasons for the change of pH during fermentation and pH regulation 

A:
  1. A change in pH can be due to a contamination 
    • Bacteria: pH sudden drops 
    • Yeast & molds: remains stable at the beginning, increases rapidly with the developing infection 
  2. Accumulation of toxic by-products like lactic acids or ammonia can change the pH 
Q:

How can the pH be regulated during the fermentation? 

A:

The pH can be influenced by: 

  1. Adding base 
  2. Using buffering system: CO2-bicarbonate based buffer: 
    • CO2-concnetration in the gas phase 
    • CO2 + H2O < => H2CO3 < => H+ + HCO3 – in the liquid phase
    • Balance between dissolved CO2 and Bicarbonate HCO3 changes in atmospheric CO2, alter the pH in the medium 
    • it is necessary to use exogenous CO2 (4-10%) 
    • Escape of carbon dioxide from the medium leads to an increase in OH-concentration (raise the pH) 


Q:

Which three proteins are necessary for attachement and where do they come from? 

A:
  1. Glycoproteins (received by the serum) 
  2. Conditioning factors (secreted by the cells themselves) 
  3. Cell surface glycoproteins (from the surface of the cell) 
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Q:

Which two sources of nutritients for cells were used? 

A:

Glucose: Glycolysis takes place under anaerobic and aerobic conditions. In this process glucose is degraded to pyruvate. Lactate is the end product of anaerobic glycolysis 


Glutamine: Glutamine -> Glutamate -> Alpha-Ketoglutarate (part of the citrate cycle), which is part of the energy generation of cells (is upregulated in cancer cells) 

Q:

Nenne Methoden der Zellauftrennung nach der Selektion mit Antibiotika für adhärente Zellen  

A:
  1. Klonierungszylinder 
  2. Wattestäbchen 
  3. Einzelzellverdünnung 
  4. Scraper 
Q:

Two terms for conversion from finite to infinite cells 

A:
  1. Transformation 
  2. Immortalization
Q:

Cryopreservation: What is added? What must be considered in terms of temperature and time during freezing? What does DMSO do? 

A:

Cryopreservatice Medium: 

  • FCS (Fatal calf serum): Protein source 
  • DMSO (Dimethyl Sulfoxide): Cryoprotectant, that prevents intracellular/extracellular crystals from forming in cells during freezing process (cause cell death) 
  • DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium)

Temperature:

  • Eukaryotic cells can be stored at temperatures below -130 °C for long periods (decades) 
    • Stored in the N2-gas phase at temperatures between -130 and -150 °C
    • Or in liquid nitrogen at -196 °C or in special refrigerators.
  • To low temperatures can cause a decrease of cell viability. 
Q:

What must be considered during cryopreservation? 

A:
  1. The cells are frozen slowly (if cells are frozen to quickly ice crystals can form causing membrane damage and cell death) 
  2. Should be checked for contamination
  3. Count the number of viable cells (cells should be in log phase) (more than 90% viability, that they can used, because a lot of cells will die because the whole process is really stressful)
Q:

What are the secondary metabolites of the glutaminolysis and glycolysis? What are the effects of lactate and ammonium accumulation on cell culture? 

A:

Gycolysis: Lactate 

Glutaminolysis: Ammonia 


Accumulation of these products may limit cell division and decrease the product manufacture and product quality.

Q:


Bewerte die Ergebnisse einer Zellzählung hinsichtlich der Genauigkeit und der Zuverlässigkeit
A:

The accuracy of the evalutation with the neubauer counting chamber always depends on the handling and the homogeneity of the sample 

-> If the sample is not properly homogenized, the result may be strongly falsified 

-> In addition, the number of cells counted is often subjective, as it is not always possible to say exactly what is a dead cell and what not 


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