DNA-Analyse an der Fachhochschule Campus Wien | Karteikarten & Zusammenfassungen

Lernmaterialien für DNA-Analyse an der Fachhochschule Campus Wien

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TESTE DEIN WISSEN

Welche der folgenden Antworten sind richtig?

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Oris von Plasmiden können entweder unidirektional oder bidirektional repliziert werden

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Was müssen sie beachten wenn sie eine DNA gleichzeitig mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen schneiden?

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Das beide Enzyme die gleichen Reaktionsbedingungen erfodern - Kompabilität der Puffersysteme muss beachtet werden - ansonsten star-activity oder gar keine Funktion 


- Puffersysteme müssen für beide Enzyme passen - sonst wäre die Enzymaktivität beeinträchtigt


Wenn man die Enzyme nicht gleichzeitig verwenden kann - kann/muss man sie hintereinander verwenden


Informationen zu den Raktionsbedingungen der einzelen Restriktionenzyme können von den Herstellern eingeholt werden

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Womit kann man die Zahl der Kopien pro Zelle verändern?

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Durch die Wahl der Methode: 


BAC’s können große Inserts aufnehmen, sind jedoch low copy (1-2 pro Zelle ),


Bakteriophagen erzeugen viele kopien, Lambda führt zur Lyse, M13 nicht.


Plasmide ähnlicher größe können auf Grund eines anderen, oder modifizierten ORI’s drastisch unterschiedliche kopienzahlen pro Zelle aufweisen. Es kann auch die Replikationszahl eines bestimmten Plasmides verändert werden, z.b durch die Reduktion der Größe (geringere Metabolische Belastung für die Zelle), durch Modifikation oder austauschen des ORI’s oder durch die Änderung externer Faktoren ( temperatur, Medium )


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Welche Aktivität fehlt dem Klenow-Fragment im Vergleich zur E.Coli DNA-Polymerase?

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  • Fehlt die 5‘-3‘-Exonuklease-Aktivität

  • (Klenow-Fragment markiert die DNA-Enden durch Auffüllen der kohäsiven Enden zu stumpfen Enden)

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Für welchen Schritt einer klonierung wird eine Reverse Transkriptase verwendet?

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RNA abhängige DNA-Polymerase macht aus einer mRNA eine cDNA

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Welche Reaktion katalysiert die T4-Polynukleotid-Kinase?

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Sie transferiert ein (das letzte; endständige=) gamma-Phosphat von ATP an das 5´-Ende von Polynucleotiden


(nützlich für die Herstellung von DNA-Fragmenten für die Ligation / die radioaktive markierung von DNA-Fragmenten mit gamma 32P ATP als phosphat donor)

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Was versteht man unter Star-activity?

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Unter Nicht-Standardreaktionsbedingungen spalten einige Restriktionsenzyme DNA-Sequenzen, die änhlich, aber nicht 100%ig der Erkennungssequenz entsprechen. Diese veränderte Spezifität wird als "star activity" bezeichnet

Besonders bei Doppelverdau zu beachten

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Woher stammt die Benennung von Restriktionsenzymen?

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Speziesname + römische Nummer

EcoR1 - > Escheria coli, R Strain, 1. Enzym

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Durch welchen Sequenzabschnitt wird die Kopieanzahl eines Plasmids geregelt?

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Origin of replication 🡪 bestimmt neben der Replikationsrate auch Wirtsbereich & Replikationsbereich

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Handelt es sich bei Restriktionsenzymen um Exo- oder Endonukleasen?

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Endonukleasen

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Was versteht man unter einem Shuttle-Vektor?

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Besitzt verschiedene ori auf dem selben Vektor für die Replikation in verschiedenen Spezies


A shuttle vector is a vector (usually a plasmid) constructed so that it can propagate in two different host species. Therefore, DNA inserted into a shuttle vector can be tested or manipulated in two different cell types. 

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Durch welche Eigenschaften zeichnen sich Typ2-Restriktionsenzyme aus

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  • Proteinstruktur: Endonuklease & Methylase getrennt

  • Erkennungsstelle: kurz (4-6bp), palindromisch

  • Spaltungsstelle: identisch mit Erkennungsstelle

  • Kein ATP-Bedarf


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Q:

Welche der folgenden Antworten sind richtig?

A:

Oris von Plasmiden können entweder unidirektional oder bidirektional repliziert werden

Q:

Was müssen sie beachten wenn sie eine DNA gleichzeitig mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen schneiden?

A:

Das beide Enzyme die gleichen Reaktionsbedingungen erfodern - Kompabilität der Puffersysteme muss beachtet werden - ansonsten star-activity oder gar keine Funktion 


- Puffersysteme müssen für beide Enzyme passen - sonst wäre die Enzymaktivität beeinträchtigt


Wenn man die Enzyme nicht gleichzeitig verwenden kann - kann/muss man sie hintereinander verwenden


Informationen zu den Raktionsbedingungen der einzelen Restriktionenzyme können von den Herstellern eingeholt werden

Q:

Womit kann man die Zahl der Kopien pro Zelle verändern?

A:

Durch die Wahl der Methode: 


BAC’s können große Inserts aufnehmen, sind jedoch low copy (1-2 pro Zelle ),


Bakteriophagen erzeugen viele kopien, Lambda führt zur Lyse, M13 nicht.


Plasmide ähnlicher größe können auf Grund eines anderen, oder modifizierten ORI’s drastisch unterschiedliche kopienzahlen pro Zelle aufweisen. Es kann auch die Replikationszahl eines bestimmten Plasmides verändert werden, z.b durch die Reduktion der Größe (geringere Metabolische Belastung für die Zelle), durch Modifikation oder austauschen des ORI’s oder durch die Änderung externer Faktoren ( temperatur, Medium )


Q:

Welche Aktivität fehlt dem Klenow-Fragment im Vergleich zur E.Coli DNA-Polymerase?

A:
  • Fehlt die 5‘-3‘-Exonuklease-Aktivität

  • (Klenow-Fragment markiert die DNA-Enden durch Auffüllen der kohäsiven Enden zu stumpfen Enden)

Q:

Für welchen Schritt einer klonierung wird eine Reverse Transkriptase verwendet?

A:

RNA abhängige DNA-Polymerase macht aus einer mRNA eine cDNA

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Q:

Welche Reaktion katalysiert die T4-Polynukleotid-Kinase?

A:

Sie transferiert ein (das letzte; endständige=) gamma-Phosphat von ATP an das 5´-Ende von Polynucleotiden


(nützlich für die Herstellung von DNA-Fragmenten für die Ligation / die radioaktive markierung von DNA-Fragmenten mit gamma 32P ATP als phosphat donor)

Q:

Was versteht man unter Star-activity?

A:

Unter Nicht-Standardreaktionsbedingungen spalten einige Restriktionsenzyme DNA-Sequenzen, die änhlich, aber nicht 100%ig der Erkennungssequenz entsprechen. Diese veränderte Spezifität wird als "star activity" bezeichnet

Besonders bei Doppelverdau zu beachten

Q:

Woher stammt die Benennung von Restriktionsenzymen?

A:

Speziesname + römische Nummer

EcoR1 - > Escheria coli, R Strain, 1. Enzym

Q:

Durch welchen Sequenzabschnitt wird die Kopieanzahl eines Plasmids geregelt?

A:

Origin of replication 🡪 bestimmt neben der Replikationsrate auch Wirtsbereich & Replikationsbereich

Q:

Handelt es sich bei Restriktionsenzymen um Exo- oder Endonukleasen?

A:

Endonukleasen

Q:

Was versteht man unter einem Shuttle-Vektor?

A:

Besitzt verschiedene ori auf dem selben Vektor für die Replikation in verschiedenen Spezies


A shuttle vector is a vector (usually a plasmid) constructed so that it can propagate in two different host species. Therefore, DNA inserted into a shuttle vector can be tested or manipulated in two different cell types. 

Q:

Durch welche Eigenschaften zeichnen sich Typ2-Restriktionsenzyme aus

A:
  • Proteinstruktur: Endonuklease & Methylase getrennt

  • Erkennungsstelle: kurz (4-6bp), palindromisch

  • Spaltungsstelle: identisch mit Erkennungsstelle

  • Kein ATP-Bedarf


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