Molekularbiologie an der BTU Cottbus-Senftenberg

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molekulare DNA-Marker Wie bioanalytisch erfasst? Welche Anwendung?

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RNA-Spezies Name & Funktion

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Führen sie an einem Organismus , ohne sequenziertes Genom, eine Expressionsanalyse durch. WIe ist das exp. Vorgehen?
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Welche zentralen Schritte der eukaryotischen Proteinbiosynthese reguliert Menge an zellulären Protein? Wie können zellphysiologische Bedingungen/ Zustände /Besonderheiten Syntheserate mobilisieren?

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Aufzählung biotech. relevanter Expressionssysteme. Nennung Einsatzmöglichkeit (Vorteil, Einschränkung, ...)

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Von großen Protein ist Oligopeptidsequenz bekannt. Beschreiben des Klonierungsverfahren des entsprechenden Gens. Nennung mobi Methoden. Identifizierung Klons muss nachvollziehbar sein (klonieren DNA in Gefäß)

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Tabelle DNA-modifizierende Enzyme in Pro & Eukaryoten -> Name & Anwendung
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Beschreiben sie das Konzept der cis- & trans-regulatorischen Genelemente. Wie werden sie exp. unterschieden?

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Funktion & Mechanismus der Anti-Termination (2 Systeme) bei der Transkription. (keine Eukaryoten)

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phys. Prozesse beruhen auf DNA-Rekombination (3Prinzipien) Prinzipien? Wie werden biotech. eingesetzt? Beispiel für jedes Prinzip +eins beschreiben

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biotech. Expression eines Gens reduzieren = zentrale Methode in Mobi Techniken beschreiben + notwendige Kontrolle
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PCR-Reaktion wurde irrtümlich dUTP statt dTTP verwendet. Fragment wird in Vektor ligiert und anschließend zur Transformation von E.coli eingesetzt. Welche Prozesse laufen in Zelle mit aufgenommenen Plasmid ab?

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Molekularbiologie

molekulare DNA-Marker Wie bioanalytisch erfasst? Welche Anwendung?
Name -> Bioanalytik -> Anwendung RFLP -> southern Blot -> Vaterschafts Test VNTR -> PCR; Elektrophorese -> Täter Identifikation STR -> PCR; Elektrophorese -> Tumordiagnostik SNP -> MicroArray; qPCR -> Mutationsdetektion

Molekularbiologie

RNA-Spezies Name & Funktion
mRNA (messenger) -> codiert Proteine rRNA (ribosomal) -> strukturelle & regulatorische Komponenten von Ribosom tRNA (transfer) -> bereitstellen von AS zur Translation snRNA (small nuclear) -> splicing snoRNA (small nucleolar) -> RNA-Nukleotidmodifikation miRNA (micro) -> Genregulation siRNA (small interfering) -> verbinden mit komplementären RiboNSmolekühl, unterbinden normale Funktion

Molekularbiologie

Führen sie an einem Organismus , ohne sequenziertes Genom, eine Expressionsanalyse durch. WIe ist das exp. Vorgehen?
1) cDNA-Bibo ertellen - spiegelt Gesamtheit mRNA wieder - Aufreinigung basierend auf Poly-A-Schwanz -Generation von cDNA durch reverse Transkriptase - Vervielfältigung (E.coli) 2) Aufteilung Batches - cDNA-Bibo wird geschnitten (DNase) - auf Plasmid verteilt & in Bakterien transformiert - je Bakterium ein Plasmid - auf Expression testen (IF, Western Blot,...)

Molekularbiologie

Welche zentralen Schritte der eukaryotischen Proteinbiosynthese reguliert Menge an zellulären Protein? Wie können zellphysiologische Bedingungen/ Zustände /Besonderheiten Syntheserate mobilisieren?
Initiation: G-Protein -> Häm-abhängige Globinprotein-Translokation Regulation Translokation des Feritin mRNA durch Eisen Beladung tRNA durch Aminoacyltransferase Kompetition Initiationsfaktoren Mobilisierung der Proteinmenge: entfernen von frei verfügbaren essentiellen AS Mangel an GTP & ATP in der Zelle

Molekularbiologie

Aufzählung biotech. relevanter Expressionssysteme. Nennung Einsatzmöglichkeit (Vorteil, Einschränkung, ...)
Prokaryoten T7-Expressionssystem: + induzierbar mit IPTG + doppelte Kontrolle durch Lac-Repressor & T7-Polymerase - braucht spez. Bakterienstämme (T7-DNA-Pol + Lac Promotor, Operator, Repressor) - keine posttranskriptionelle Modifikationen, keine Faltung Proteine Eukaryoten Ecdyson-System Tet-On / Tet-Off-System = induzierbare Expressionssysteme Virale System: Retrovieren, Adenovieren Bacalovirus-Expressionssystem + relativ günstig + hohe Expressionsrate + nur S1-Labor notwendig - aber unvollständig

Molekularbiologie

Von großen Protein ist Oligopeptidsequenz bekannt. Beschreiben des Klonierungsverfahren des entsprechenden Gens. Nennung mobi Methoden. Identifizierung Klons muss nachvollziehbar sein (klonieren DNA in Gefäß)
Blast mit Oligopeptidsequenz -> herausfinden des codierten Gens chem. Synthese von Hybridisierungs DNA-Sonden -> binden spez. an Gen genomische DNA-Bibo herstellen -> Genom mit Restriktionsenzym -> schneiden Plasmid mit selben Endonuclease, Ligation der Fragmente in Plasmid -> Transformation in Bakt. , ausplattieren auf Agar mit Filter Lyse der Zelle, Denaturieren DNA, Hybridisieren Filters (DNA von Kolonie) mit markierter Sonde, bei Signal hat Hybridisiert -> Kolonie pro Signal von Replikplatte nehmen und weiter ausplattieren -> nach Kultivierung, Lyse Zellen, Plasmid Aufreinigung, Plasmid mit Gen für Protein

Molekularbiologie

Tabelle DNA-modifizierende Enzyme in Pro & Eukaryoten -> Name & Anwendung
NUCLEASEN: Abbau NS durch Aufbrechen Phospodiester-Brücke ENDONUKLEASEN: spalten Phosphodiester-Brücke im innerne NS EXONUKLEASEN: bauen NS von Ende her ab POLYMERASE: synthetisieren NS POLYNUCLEOTID-KINASE: überträgt Phosphat-Gruppe von ATP auf 5´Hydroxy-Gruppe PHOSPHAZASEN: hydrolysieren Phosphomonoester-Bindung METHYLTRANSFERASE: modifizieren DNA durch kovalente Bindung Methylgruppe an C oder A

Molekularbiologie

Beschreiben sie das Konzept der cis- & trans-regulatorischen Genelemente. Wie werden sie exp. unterschieden?
cis: DNA-Elemente die nicht Protein kodieren, regulatorische Funktion (Promotor, Enhancer) trans: regulatorische Proteine bzw. Gene von Proteinen besonders TSF, die über DNA-Bindung Genexpression regulieren Experiment: Mutation in einzelnen Elementen einsetzen -> RNA von TSF gebildet => trans -> cis durch Zugabe Proteinmix Affinitätsreinigung, Band-Shift

Molekularbiologie

Funktion & Mechanismus der Anti-Termination (2 Systeme) bei der Transkription. (keine Eukaryoten)
Antitermination -> verhindert frühzeitige Termination der Transkription -> Überlesen eines Terminationssignals & dadurch erst Tumination bei erreichen des 2. Terminationssignals Attenuation -> Antitermination bei Trp-Operon - abhängig von Konzentration/ Verfügbarkeit an Trp in Zelle - Antitermination nur bei Trp-Mangel -> Antitermination bei ~Phagen-Transkription - nur wenn N bereits synthetisiert wurde (N-Protein) bildet es mit A-Protein einen Antiterminationskomplex - RNA-Pol transhibiert weiter nach ablesen des Stopp-Signals - wichtig für lytischen Lebenszyklus - Schleifenprinzip 1,2,3,4 Transkription abgebrochen -> mRNA bilden haarnadelförmige Sekundärstruktur als Terminationssignal

Molekularbiologie

phys. Prozesse beruhen auf DNA-Rekombination (3Prinzipien) Prinzipien? Wie werden biotech. eingesetzt? Beispiel für jedes Prinzip +eins beschreiben
1) homologe Rekombination -> Herstellung knock-out Mäuse 2) Orts-spez. Rekombination -> Gateway-Cloning 3) Transkription -> Transposon-Mutagenese - 2 Plasmide (2-komporate-Systeme) a) IRs (Internal Repeats) mit GOI (gene of interest) dazwischen +Resistenz b) Transposase (cDNA) im Plasmid -> transformieren in z.B. E.coli -> Transposase wird exprimiert -> erkennt IRS auf Plasmid (a) und schneidet DNA-Bereich dazwischen aus -> inseriert sie an zufälligem Ort in Bakt. Genom -> Vorteil: GOl sehr leicht auffindbar, da Sequenz von GOI bekannt

Molekularbiologie

biotech. Expression eines Gens reduzieren = zentrale Methode in Mobi Techniken beschreiben + notwendige Kontrolle
(1) Zugabe siRNA mit passender Sequenz zur mRNA des Gens, Expression repressiert werden soll 48h warten, messen RNA mit realTime-PCR Kontrolle: 1) negativ -> Zugabe von (RNA) 2) I-> keine Zugabe von siRNA 3) positiv -> Zelle, die Gen nicht expremiert

Molekularbiologie

PCR-Reaktion wurde irrtümlich dUTP statt dTTP verwendet. Fragment wird in Vektor ligiert und anschließend zur Transformation von E.coli eingesetzt. Welche Prozesse laufen in Zelle mit aufgenommenen Plasmid ab?
Desaminierung: dUTP ist kein normaler DNA-Baustein -> Mutationsindikator wird als Signal zur Reparatur des Vektors erkannt anlagern von Uracil-N-Glycolase entfernt Uracil-Reste (Base excicion repair) danach wird Phosphatrückrat gespalten und somit das Plasmid fragmentiert -> dort wo Fragment eingesetzt wurde => Verunreinigung & damit falsch positive Ergebnisse durch dUTP (statt dTTP) + Enzym Uracil-N-Glycosylase verhindert - Uracil-Reste aus DNA entfernt

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