Gentechnik an der BTU Cottbus-Senftenberg

Karteikarten und Zusammenfassungen für Gentechnik an der BTU Cottbus-Senftenberg

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Welche Blotting-Techniken gibt es?

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Helicase ATP-Verbrauch?

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Enzymreaktion der T4-Ligase + Voraussetzungen des DNA-Moleküls dafür?

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Mikroinjektion?

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PCR?

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Definition “Gen“?

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Klonierungsvektor?
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grundlegende Methoden der Gentechnik?

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Nach welcher Faustformel berechnet man die Schmelztemperatur eines Oligonucleotids & welcher Anteil der DNA liegt bei dieser Temperatur einzelsträngig vor?

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RT-PCR?

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Was ist eine Genbank?

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Welche Grundtypen von DNA-Polymerasen werden bei der PCR benutzt? Worin unterscheiden diese sich voneinander, was sind Vor- & Nachteile?

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Gentechnik

Welche Blotting-Techniken gibt es?
  • Southern Blot: Nachweis DNA
  • Northern Blot: Nachweis RNA
  • Western Blot: Nachweis Proteine
  • South Western Blot: Nachweis DNA-bindende Proteine

Gentechnik

Helicase ATP-Verbrauch?
Ja

Gentechnik

Enzymreaktion der T4-Ligase + Voraussetzungen des DNA-Moleküls dafür?

  • repariert nicks in DNA-Strang

  • Generiert Phosphodiesterbindung unter ATP-Verbrauch

  • Ligiert blunt und sticky ends

  • Bei niedriger Temp -> höhere Chance das Enden sich finden 


Voraussetzungen:

  • Magnesium vorhanden
  • 5'-Phosphat
  • Freies 3'-OH
  • DNA / RNA muss doppelsträngig sein
  • mindestens 5 gepaarte Nucleinbasen müssen da sein

Gentechnik

Mikroinjektion?
Einbringen der DNA mit sehr feiner Glaskapillare unter dem Mikroskop direkt in den Kern der Zelle

- prinzipiell für alle eukaryontischen Zellen möglich
- Anwendung besonders bei Zucht transgener Tiere (Injektion in Vorkern einer Eizelle)

Gentechnik

PCR?
= Polymerase chain reaction
1982 von Mullis -> 1985 Verbesserung durch Taq-Polymerase

Selektive Vervielfältigung/Amplifizierung eines gewünschten DNA-Abschnitts (Template DNA-Molekül) mittels Polymerasen

1. Denaturierung: ca. 90°C
  • Auftrennung der DNA in Einzelstränge

2. Hybridisierung: ca. 60°C
  • Anlagerung der spezifischen Primer an die 3'-Enden der DNA-Einzelstränge = Annealing)

3. Polymerisation: ca. 70°C
  • DNA-Polymerasen beginnen an den Primern am 3'OH Ende, Synthese von 5' nach 3' mit Elongation - Entstehung von zwei DNA-Doppelsträngen
 → Wiederholung dieser drei Schritte (2. Zyklus, 3. Zyklus …)

Gentechnik

Definition “Gen“?
= DNA-Abschnitt im Erbgut von Lebewesen enthaltenen Erbinfos, die zur Bildung zellulären und extrazellulären Proteine und RNA-Molekülen einer Zelle dient

Gentechnik

Klonierungsvektor?
DNA-Molekül, das

- als Träger von Fremd-DNA dient
- ggf. selbständig in eine Wirtszelle „eindringen“ kann
- sich in der Wirtszelle vermehren kann

Meist verwendet:
- Plasmide
- Bakteriophagen
- Viren

Gentechnik

grundlegende Methoden der Gentechnik?
- PCR und RT-PCR
- DNA-Sequenzierung
- Southern Blotting
- Klonieren
- Verfahren zum Transfer von Fremd-DNA in pflanzliche Zellen

DNA-Enzyme als Werkzeug?

Gentechnik

Nach welcher Faustformel berechnet man die Schmelztemperatur eines Oligonucleotids & welcher Anteil der DNA liegt bei dieser Temperatur einzelsträngig vor?

 4x(G+C) + 2x(A+T)


Tm = die Temperatur, bei der 50% der Oligonucleotide einzelsträngig vorliegen.

Gentechnik

RT-PCR?
= Reverse-Transkriptase-PCR

  • RNA als Template

1. Isolierung RNA
2. Erststrangsynthese: umschreiben der RNA in cDNA mittels Reverse Transkriptase und Oligo-dT Primern
3. PCR mit genspezifischen Primern
4. Analyse: Gelelektrophorese, Sequenzierung

-> cDNA = copy/complementary DNA

Gentechnik

Was ist eine Genbank?

= enthält Sequenzen und DNA-Moleküle; Sammmung von DNA- oder cDNA-Klonen

genom. Lambda-Phagen-Bib Genklonierung: 
  • Humane DNA-> partieller Verdau -> 20kb Fragmente mit sticky ends
  • Lambda-Bakteriophage-DNA -> entfernen der replizierbaren Regionen -> Lambda-Vektor mit sticky ends
  • Zusammengeben der Fragmente    -> Ligation -> rekombinante Lambda-Phagen-DNA 
  • Durch Verpackung mit in-vitro Phage assembly -> humane DNA in Phage verpackt 
  • Infektion der E.coli -> Genbank unserer humanen DNA

Gentechnik

Welche Grundtypen von DNA-Polymerasen werden bei der PCR benutzt? Worin unterscheiden diese sich voneinander, was sind Vor- & Nachteile?

  • Taq-Pol
    • 3'-dA Überhänge
    • DNA-Polymerase, hitzestabil
    • Billig
    • Keine Proofreadingaktivität
    • Hohe Fehlerrate
    • Rekombinant selber herstellbar
    • kann keine RNA-Fragmente amplifizieren
  • Pfu-Pol 
    • Blunt ends
    • Teuer
    • Langsamer als Taq, oft in Kombi eingesetzt
    • 3' - 5' Proofreadingaktivität
    • Geringe Fehlerrate
  • RT-Pol
    • Kombination aus Reverser Transkriptase & DNA-Polymerase, hitzestabil
    • kann RNA-Fragmente zu cDNA umschreiben, die amplifiziert werden kann

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