Gentechnik an der BTU Cottbus-Senftenberg

Karteikarten und Zusammenfassungen für Gentechnik im Biotechnologie Studiengang an der BTU Cottbus-Senftenberg in Cottbus

CitySTADT: Cottbus

CountryLAND: Deutschland

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Beschreibe eine Möglichkeit eine DNA-Sonde nicht-radioaktiv zu markieren.

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Beschreiben Sie die Schritte zur Herstellung einer cDNA-Bank.

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Welche Grundtypen von DNA-Polymerasen werden bei der PCR benutzt? Worin unterscheiden diese sich voneinander, was sind Vor- & Nachteile?

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Nenne Vor- und Nachteile von Genbanken.

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Enzymreaktion der T4-Ligase + Voraussetzungen des DNA-Moleküls dafür?

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Beschreibe eine Möglichkeit die DNA-Sonde radioaktiv zu markieren.

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Anwendung viraler Vektoren?

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Eukaryotische Promotoren in induzierbaren Ecpressionssystemen.

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Was ist eine Genbank?

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Vorteile, Nachteile und Anwendung der  Kombination RT-PCR mit konventioneller PCR?

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Anwendungen der T4-DNA-Polymerase?

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Was ist Gentherapie?

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Gentechnik

Beschreibe eine Möglichkeit eine DNA-Sonde nicht-radioaktiv zu markieren.
  • ddNTPs chemisch synthetisieren um Fluorophore anzubringen

Biotin-11-dUTP

  • Biotin bindet an Streptavidin (Affinität)
  • Wird über Random-Priming oder Nick Translation in DNA integriert
  • Eingebautes Bioton wird durch Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase, nachgewiesen 
  • durch Anti-Streptavidin-AK 

Gentechnik

Beschreiben Sie die Schritte zur Herstellung einer cDNA-Bank.

1. Isolierung der RNA nach mRNA-Isolierung  -> Oligo dT-Säule

2. Erstetrangsynthese mit RT, Oligo dT Primer und RNA-abhängigen DNA-Pol -> Olido dT ist komplementär zu PolyA-Schwanz der mRNA -> cDNA

3. Partieller Verdau der RNA durch RNAseH

4. Zweitstrangsynthese mit DNA-Pol

5. Ligation von Linkern und Klonierung dee cDNA-Moleküle in Vektor -> Amplifikation der cDNA

-> Bank enthält nur DNA , die komplementär zu in der Zelle vorhandener mRNA ist

Gentechnik

Welche Grundtypen von DNA-Polymerasen werden bei der PCR benutzt? Worin unterscheiden diese sich voneinander, was sind Vor- & Nachteile?

  • Taq-Pol
    • 3′-dA Überhänge
    • DNA-Polymerase, hitzestabil
    • Billig
    • Keine Proofreadingaktivität
    • Hohe Fehlerrate
    • Rekombinant selber herstellbar
    • kann keine RNA-Fragmente amplifizieren
  • Pfu-Pol 
    • Blunt ends
    • Teuer
    • Langsamer als Taq, oft in Kombi eingesetzt
    • 3′ – 5′ Proofreadingaktivität
    • Geringe Fehlerrate
  • RT-Pol
    • Kombination aus Reverser Transkriptase & DNA-Polymerase, hitzestabil
    • kann RNA-Fragmente zu cDNA umschreiben, die amplifiziert werden kann

Gentechnik

Nenne Vor- und Nachteile von Genbanken.

Vorteile:

  • Abbilden des gesamten Genoms
  • Jeden beliebigen Abschnitt des entsprechenden Genoms bzw. cDNA im Transkriptom finden

Nachteile:

  • Kann keine Aussage machen über die Expression größerer Fragmente da Introns enthalten sind

Gentechnik

Enzymreaktion der T4-Ligase + Voraussetzungen des DNA-Moleküls dafür?

  • repariert nicks in DNA-Strang

  • Generiert Phosphodiesterbindung unter ATP-Verbrauch

  • Ligiert blunt und sticky ends

  • Bei niedriger Temp -> höhere Chance das Enden sich finden 

Voraussetzungen:

  • Magnesium vorhanden
  • 5′-Phosphat
  • Freies 3′-OH
  • DNA / RNA muss doppelsträngig sein
  • mindestens 5 gepaarte Nucleinbasen müssen da sein

Gentechnik

Beschreibe eine Möglichkeit die DNA-Sonde radioaktiv zu markieren.
  • Radioaktiv markierte Primer 

Oder radioaktiv markierte dNTPs 

  • alpha-32P-dCTP
  • alpha-35S-dATP
  • gamma-23P-ATP

Einbringen der radiaktiv markierten dNTPs durch Nick Translation
= ss-Brüche durch DNAse1 in DNA eingefügt -> Phosphodiesterbindung gespalten

  • In Anwesenheit von Magnesium
  • DNA-Pol hat 5′-3′ Exonukleaseaktivität -> entfernt nacheinander Nukleitide an DNA-Strang 
  • Durch markierte dNTPs Lücke aufgefüllt 
  • Prozess bis zum Ende weitergeführt, dadurch bewegt sich der nick von 5′-3′ und der Strang wird an einigen Stellen markiert durch z.B makiertes Cytosin

Gentechnik

Anwendung viraler Vektoren?

  • Transfer viraler DNA
  • Zielzellen
  • Genomintegration

Gentechnik

Eukaryotische Promotoren in induzierbaren Ecpressionssystemen.

  • Ecdysone Promotor
  • MMTV LTR
  • Tet-Promotor

Gentechnik

Was ist eine Genbank?

= enthält Sequenzen und DNA-Moleküle; Sammmung von DNA- oder cDNA-Klonen

genom. Lambda-Phagen-Bib Genklonierung: 

  • Humane DNA-> partieller Verdau -> 20kb Fragmente mit sticky ends
  • Lambda-Bakteriophage-DNA -> entfernen der replizierbaren Regionen -> Lambda-Vektor mit sticky ends
  • Zusammengeben der Fragmente    -> Ligation -> rekombinante Lambda-Phagen-DNA 
  • Durch Verpackung mit in-vitro Phage assembly -> humane DNA in Phage verpackt 
  • Infektion der E.coli -> Genbank unserer humanen DNA

Gentechnik

Vorteile, Nachteile und Anwendung der  Kombination RT-PCR mit konventioneller PCR?

Vorteil:

  • Bessere Quantifizierung 
  • Weniger RNa benötigt 

Nachteil:

  • Teure Maschinen und Reaktionskomponenten

Anwendungen:

  • Genexpressionsanalyse
  • SNP-Analyse
  • Expressionsprofiling
  • Pathogen Detektion

Gentechnik

Anwendungen der T4-DNA-Polymerase?

  • 5′ Übergänge auffüllen
  • Ortsspezifische Mutagenese
  • blunt PCR-Produkt mit 3′-dA Überhang erzeugen 
  • Ecoreaktion zum entfernen der 3′ Überhänge, gefolgt von Pol-Reaktion

Gentechnik

Was ist Gentherapie?

= Insertion von Genen in Zellen von Individuen oder Geweben zur Therapie einer Krankheit

  • In-vitro: Transfer direkt in Tellen in lebenden Organismen 
  • Ex-vivo: Transfer in Primärzellen und Kultivierung in genmanipulierten Zellen mit anschließender Rücktransplantation
Gradient

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