Genetik - der genetische Code an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

Karteikarten und Zusammenfassungen für Genetik - der genetische Code im Biologie Studiengang an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg in Freiburg

CitySTADT: Freiburg

CountryLAND: Deutschland

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Interkalierende Substanzen

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UV-Strahlung induziert die Bildung eines Cyclobutanringszwischen benachbarten Thyminen


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Beschreibe die Gelelektrophorese 

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CRISPR/Cas9-Systeme funktionieren in Bakterien, Archaea, Eukaryoten, inkl. Pflanzen, Pilze und Mensch, um:

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 Revertanten

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Die wichtigsten Werkzeuge im Enzymrepertoire der Gentechnik

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Klonierungsvektoren

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Ames Test

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Basenanaloga

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Prinzip der “Shot-gun” Klonierung und Sequenzierung


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CRISPR

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Wie viele der Codons codieren für Aminosäuren und was codiert der Rest?

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Genetik - der genetische Code

Interkalierende Substanzen

Unter Interkalation (von lateinisch intercalare = einschieben) im chemischen Sinn versteht man die Einlagerung von Molekülen, Ionen (selten auch Atomen) in chemische Verbindungen, wobei diese ihre Struktur während des Einlagerungsprozesses nicht wesentlich verändern.

– InterkalierendeSubstanzen sind flache Moleküle, die sich zwischen Basen einlagern →  Deletionenoder Insertionen (Sie werden im Labor häufig zum Färben von DNA verwendet)
– Ethidium, Proflavin, Acridinorange

Genetik - der genetische Code

UV-Strahlung induziert die Bildung eines Cyclobutanringszwischen benachbarten Thyminen


Reparatur von UV-Schäden: Photoreaktivierung mit Hilfe der DNA-Photolyase
Þ Die Photoreaktivierung ist eine direkte Reversion des DNA-Schadens

Genetik - der genetische Code

Beschreibe die Gelelektrophorese 

DNA-Fragmente können in einer Gelelektrophorese nach Größe aufgetrennt werden. 

Sie wandern aufgrund des negativ geladenen Phosphatrückgrates im elektrischen Feld zur Anode [Kationen (+) wandern zur Kathode und Anionen (−) zur Anode, das wird oft verwechselt], wobei sie von der Gelmatrix mechanisch aufgehalten werden. Je kleiner die Fragmente sind, desto leichter „flutschen“ sie durch die Matrix. 

Darauf beruht die Trennung. Die DNA kann im Gel mit Ethidiumbromid angefärbt und damit sichtbar gemacht werden.

Laufrichtung des Gels – zu +

– Anfärbung des Geles mit Ethidiumbromid 

– Sichtbarmachung mit UV-Licht 

– Abstrahlen von sichtbarem Licht

Genetik - der genetische Code

CRISPR/Cas9-Systeme funktionieren in Bakterien, Archaea, Eukaryoten, inkl. Pflanzen, Pilze und Mensch, um:

(i) Deletionen einzufügen (durch Homologie-abhängige Reparatur mit einem Template mit einer Lücke).
(ii) Insertionen einzufügen (durch Homologie-abhängige Reparatur mit einem Template mit einer synthetischen DNA)
(iii) Genetische Deletionen einzufügen
(iv) Genexpression zu erhöhen (durch dCas9Kopplung an einen Transkriptionsaktivator)
(v) Genexpression zu reprimieren (durch dCas9-Kopplung an einen Repressor)
(vi) um ein Fusionsprotein an eine bestimmte Stelle der DNA zu bringen (Kopplung an dCas9)
(vii) Live lebende Zellen zu analysieren (durch Bindung eines fluoreszierenden Moleküls an dCas9)
(viii) den epigenetischen Status zu manipulieren (z. B. durch dCas9-Kopplung an einen Modulator des Histonzustandes)

Genetik - der genetische Code

 Revertanten

Zellen, die wieder den ursprünglichen Phänotyp aufweisen
– Mutation im selben Ort der DNA
– Mutation an einem anderen Ort in der DNA
– Suppressor-Mutation (Kompensation des Effekts der ursprünglichen Mutation)

Genetik - der genetische Code

Die wichtigsten Werkzeuge im Enzymrepertoire der Gentechnik

• Restriktions-Endonukleasen
• DNA-Ligase
• Terminale Transferase
• Reverse Transkriptase
• DNA-Polymerase
• Hitzestabile DNA-Polymerase

Genetik - der genetische Code

Klonierungsvektoren

Entwickelt auf der Grundlage von natürlich vorkommenden Plasmiden
Eigenschaften:
• Struktur und Molekulargewicht: kompakte (kleine), ringförmig geschlossene Plasmidmoleküle
• Kopienzahl: meist hoch
• Resistenzgen: zur Selektion, z. B. Ampicillinresistenz
• Replikationsursprung: für ihre Vermehrung
• Polylinker („multiple cloning site“): künstlich eingefügte Region, die eine Reihe singulärer Restriktionsschnittstellen enthält
Fakultative Eigenschaften:
• Markergene für erleichtertes screening (lacZ, „blau-weiß-Selektion“)
• Promotoren zur regulierten Genexpression

Genetik - der genetische Code

Ames Test

Testverfahren, um (chemische) Mutagene zu identifizieren

– Es werden Bakterien, die durch Mutation (z. B. Punktmutation) in einem Gen nicht mehr in der Lage sind, eine bestimmte Aminosäure zu synthetisieren (sogenannte Mangelmutanten, siehe Auxotrophie), auf einen diese Aminosäure nicht enthaltenden Nährboden (Agar) aufgebracht. Da diese Bakterien zur Fortexistenz auf diese Aminosäure angewiesen sind, würden sie absterben bzw. könnten sich nicht auf diesem Mangelmedium vermehren. Die Aminosäure (z. B. Histidin) ist für die Synthese von Proteinen und somit für Zellteilung vonnöten.
Nun setzt man die Bakterien dem potentiellen Mutagen aus, indem man beispielsweise ein damit getränktes Filterpapier auf den Nährboden auflegt. Bilden sich nach dem anschließenden Bebrüten sogenannte Bakterien-Kolonien, so sind einzelne Bakterien gewachsen und haben die Fähigkeit zur Synthese der entsprechenden Aminosäure zurückerlangt. Es handelt sich hierbei um sogenannte Revertanten, bei denen die zur Auxotrophie führende Punktmutation in einem Gen rückgängig gemacht wurde – sie wurden wieder prototroph. Man geht davon aus, dass diese Rückmutation sehr wahrscheinlich der Wirkung des zugegebenen Agens zuzuschreiben ist und es sich somit um ein Mutagen handelt, welches eine Punktmutation in einem Gen bewirkt. In der Regel tritt eine solche Rückmutation auch spontan von selbst auf, jedoch in viel geringerem Maßstab, das heißt wesentlich seltener als bei Anwesenheit eines mutagenen Agens.
Meist setzt man im Ames-Test Bakterienstämme von Escherichia coli (Tryptophan-Auxotrophie) oder Salmonella typhimurium (Histidin-Auxotrophie) ein.
Salmonella typhimurium zeichnet sich neben seiner Histidin-Bedürftigkeit noch durch zwei weitere Eigenschaften aus, die für den Ames-Test von Vorteil sind: Zum Einen besitzt es einen Defekt im DNA-Reparatursystem, sodass die entstandene Mutation nicht behoben werden kann; es gibt sozusagen keine Dunkelziffer. Zudem besitzt dieses Bakterium verkürzte Lipopolysaccharide, wodurch die Membran durchlässiger ist und potentielle Mutagene nicht schon dort ganz oder teilweise abgehalten werden. Beide Eigenschaften führen zu einer Erhöhung der Aussagekraft des Ames-Tests.

Genetik - der genetische Code

Basenanaloga

Substanzen, die in ihrer chemischen Struktur mit den natürlichen Purinbasen (Adenin und Guanin) bzw. Pyrimidinbasen (Cytosin und Thymin bzw. Uracil) verwandt sind und deshalb anstelle dieser Basen in DNA (Desoxyribonucleinsäuren) bzw. RNA (Ribonucleinsäuren) eingebaut werden können. Verändern die Basenanaloga durch eine tautomere Umlagerung (Tautomerie) oder durch Ionisation kurzfristig ihre Paarungseigenschaften (Basenpaare, Basenpaarung), so bewirken sie im Verlauf der nächsten Replikationsrunden (Replikation) Punktmutationen

– 5-Bromouracil paart in der seltenen Enolformmit Guanin →  A=T zu G   C Transition

Genetik - der genetische Code

Prinzip der “Shot-gun” Klonierung und Sequenzierung


– durch Craig Venter
– DNA wird mechanisch geschert (durchziehen durch eine Kanüle oder mittels Ultraschall)
– Kurze Fragmente werden individuell kloniert und dann sequenziert. Im Ergebnis entstehen viele Tausend individuelle Sequenzfragmente die sich überlappen.
– Die komplette Genomsequenz wird dann im Computer “zusammengebaut“

(Das Prinzip des „shot gun cloning“ war schon länger für prokaryotische Genome bekannt.
– Bakteriengenome haben eine einfache Organisation
– geringe Zahl an Genen (1.000 – 10.000)
– hohe Kodierungsdichte
– wenige repetitive DNA-Elemente
– meist zirkulär organisiert Operon
Wurde duch J.C. Venter auf große und komplexe eukaroytische Genome übertragen. Schlüssel: Entwicklung leistungsfähiger Bioinformatik)

Genetik - der genetische Code

CRISPR

– die „größte Bio-Tech Entdeckung des Jahrhunderts“

• Abkürzung für: „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“
• CRISPR existieren natürlicherweise in Bakterien und Archaea
• CRISPR sind Abschnitte von DNASequenzwiederholungen (repeats)
• Bestimmte CRISPR/Cas-Systeme sind die Grundlage zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Organismen
• CRISPR bilden die Grundlage eines prokaryotischen Immunsystems (1. Elemente sind die CRISPR repeat-spacer– Kassetten und assoziierte Gene („cas“-Gene). 2. Dringt fremde DNA (z. B. von Bakteriophagen) in die Zelle ein, werden Fragmente herausgeschnitten und als neuer „spacer“ in eingebaut, diese „spacer“ werden als nicht-kodierende RNAs transkribiert und leiten den Interferenzkomplex (cas-Genprodukte) auf eventuell erneut eindringende Fremd-DNA (manchmal auch auf dessen RNA). 4. Die Fremd-DNA wird durch Basenpaarungen erkannt und zerstört – Die Zelle ist immun)

Genetik - der genetische Code

Wie viele der Codons codieren für Aminosäuren und was codiert der Rest?

– 61 Codons codieren für die insgesamt 20 kanonischen der proteinogenen Aminosäuren 

– die restlichen drei sind sogenannte Stopcodons zur Termination der Translation 

Gradient

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