Lernmaterialien für GENOMIKA I PROTEOMIKA an der University of Zagreb

1. NORTHERN BLOTTING ( RNA/DNA)

2. DNA microarray- otkriva u kojim stanicama je gen eksprimiran pa se na temelju toga zaključuje njegova funkcija...

FIZIČKA= daje informaciju o pravoj fizičkoj udaljenosti određenih parova baza

              = temelji:  direktno sekvenciranje molekule DNA (nekad Sanger, danas next generation   sequencing) 

• shotgun metoda služi za izradu takve karte ( nasumično razrežemo genom, preklapanjem određenih regija ustanovimo u kojem su dijelu genoma pripadali i tako rekonstruiramo kompletnu DNA sekvencu pomoću fragmenata)

GENETIČKA= daje nam točan položaj gena i njihove udaljenosti u cM

                     = temelji se na vezanosti gena i postotku rekombinacije

                     = ORF (open reading frame) = metoda kojom tražimo gene koji kodiraju za proteine.... cilj je pronaći sekvencu koja počinje STAR kodonom i ne završava prerano sa STOP kodonom kako bi se uvjerili da ona uistinu može kodirati za protein)

Tehnika koju koristimo kada tražimo koji to gen kodira za neki protein !

Dakle, fokus je na sekvenci DNA, tj. genu.

Stoga, :

1. pronađemo START kodon
2. we make sure da je sekvenca dovoljno duga da  ne sadrži prerano STOP kodon kako bi mogla kodirati za taj protein...

OK, dakle:

2 bitna dijela nekodirajuće DNA su INTRONI i visoko ponavljajuće sekvence!

2 vrste:

1. DNA TRANSPOZONI

•  "cut and paste"
• imaju gen za enzim transpozaza koji se veže za oba kraja tog transpozona
• enzim transpozaza izreže određen slijed nukleotida i premjest ga na neko drugo mjesto gdje je također prije izrezala nukleotide

2. RETROTRANSPOZONI

= " copy and paste " ----> kratke DNA sekvence koje prvo naprave mRNA, imaju u sebi gen za enzim reverzna transkriptaza koja će pretvoriti RNA nastalu transkripcijom u DNA i onda će se ona ubaciti na neko drugo mjesto u DNA molekuli ===>> dobili smo RETROTRANSPOZON !

• ERV ( endogeni retrovirusi)
  • endogeni su jer se ugrade u genom spolnih stanica i tako nasljeđuju
  • sadrže LTR ( retroviral like long terminal repeats) = ponavljajuće sekvence
• neviralni transpozoni
  • LINE = visoko ponavljajući dugi + raspršeni elementi
  • SINE= visoko ponavljajući kratki + raspršeni elementi
    • DNA sekvence koje su nekada bile RNA molekule, ali ih je reverzna transkriptaza prepisala u cDNA i ugradila u genom  ( ta RNA je trebala stvoriti neki protein prije nego je se rev. transk. dočepala )
    • Alu sekvenca je najčešća ( 300 pb)

1. METILACIJA DNA

• preko 90 % 5mC nalazi se upravo u RETROtranspozonima; metiliramo promotor, gubitkom metilacije aktivirali transpozone i  otvorili mogućnost pojave mutacije !

2. NEKODIRAJUĆE RNA ( micro RNA i siRNA)

= POANTA: stvorili smo dvolančanu RNA i onemogućili stvaranje defektnog proteina koji bi ionako nastao od muitranog transpozona...

• micro RNA= parcijalna hibridizacija, tj. komplementarnost
  • inhibira TRANSLACIJU !
• siRNA= potpuna hibridizacija, tj. komplementarnost
  • razgradi RNA ( RISC, Dicer) inhibira TRANSKRIPCIJU !