Maus-Genetik at Universität zu Köln

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flox&delete-Strategie

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Rekombinase

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konditionale Mutagenese

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Ovidukttransfer (Eileitertransfer)

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Blastozyste der Maus

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Welche Möglichkeiten gibt es für die zielgerichtete Mutation in Es-Zellen?

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Welches Geschlecht haben die meisten ES-Zellinien?

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Transfektion

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Ablauf Cre/loxP

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Cre/loxP System

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Chimären

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Wie verläuft die Aktivierung der Rekombinase für die zielgerichtete Rekombination?

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Maus-Genetik

flox&delete-Strategie
  1. homologe Rekombination (2 Stämme werden gekreuzt)
  2. ortsspezifische Rekombination (Promotor wird neu verortet)

–> komplette Deletion eines Gens
–> gefloxter Locus, wobei ein Gen nicht abgelese wird

Maus-Genetik

Rekombinase

 Proteine, welche die Neuverknüpfung zweier DNA-Stränge katalysieren

Maus-Genetik

konditionale Mutagenese

Ablauf:

  1. homolge Rekombination: zum Einbau von Zielsequenzen für eine Rekombinase
  2. ortsspezifische Rekombination: durch Einführung & Aktivierung einer Rekombinase

Maus-Genetik

Ovidukttransfer (Eileitertransfer)
  • findet unter Narkose statt
  • dient der Erzeugung gentechnisch veränderter Mäuse
  • Embryo wird mittels geladener Kapillare in den Eileiter übertragen über die trompetenförmige Öffnung

Maus-Genetik

Blastozyste der Maus
  • 3,5 Tage Alter Embryo
  • ca. 32 Zellen
  • besitzt großen mit Flüssigkeit gefüllten Hohlraum (Blastozoel)
  • Zellen der inneren Zellmasse sind an einer Seite des Hohlraums
  • Trophektoderm = äußere Schicht der Zellen

Maus-Genetik

Welche Möglichkeiten gibt es für die zielgerichtete Mutation in Es-Zellen?
  1. homologe Rekombination
  2. zielgerichtetes Schneiden der DNA an ausgewählten Stellen im Genom durch Nukleasen

Maus-Genetik

Welches Geschlecht haben die meisten ES-Zellinien?

männlich –> leichte Vermehrung mit vielen Weibchen

Maus-Genetik

Transfektion

Einführung von gereingter DNA in intakte lebende Zellen durch eine elektrische Entladung, die die Zellen für einen kurzen Zeitraum für DNA durchlässig macht

Maus-Genetik

Ablauf Cre/loxP
  • Gen wird links & rechts mit Erkennungssequenzen loxP-sites der Cre-Rekombinase markiert
  • wenn beide loxP in selbe Richtung zeigen, gib es eine Deletion (ireversibel)
  • wenn beide loxP aufeinander zeigen, gibt es eine Inversion (reversibel)
  • Die Expression der Cre-Rekombinase kann durch entsprechende Promotor reguliert werden
  • Nach Aktivierung der Cre-Rekombinase wird die Sequenz zwischen den loxP-Sites durch Rekombination entfernt

Maus-Genetik

Cre/loxP System

= sequenzspezifisches Rekombinationssystem, für Erzeugung von Knockout-Mäusen

  • kein totaler Gen-Knockout, sondern konditionaler Knockout
  • Ausschaltung des entsprechenden Gens in einzelnen Geweben oder zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten

Rekombinationssystem:
Cre (causes of recombination) = Enzym –> gewebespezifisch durch Promotor, Ligandenabhängig (induzierbar)
lox (locus of crossing over) = Erkennungsstelle
P (from bateriophage P1)

Maus-Genetik

Chimären
  • gehen aus Mikroinjektion von ES-Zellen ind Blastozysten hervor
  • embryonale Stammzellen wurden injiziert und vermischen sich mit eigenen
  • sind an Musterung im Fell erkennbar, da die gekreuzten Mäusestämme sich unterscheiden

Maus-Genetik

Wie verläuft die Aktivierung der Rekombinase für die zielgerichtete Rekombination?
  1. transiente Transfektion von ES-Zellen (bleibt außerhalb des Genoms, Sequenz bleibt als Plasmid): Vorkerninjektion eines ringförmigen Plasmids (transientes Transgen), Injektion eines viralen Vektors der Cre expremiert ins Zielgewebe
  2. Kreuzung mit einer transgenen Maus für das Cre Gen (stabile Einbindung des Fragments ins Genom)

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