gt at Universität Würzburg

• Sammelbezeichnung für neue molekularbiologische Verfahren, mit denen gezielt Mutationen in bestimmten Abschnitten der DNA herbeigeführt werden
• An- und Ausschaltung, Einfügen und Entfernen von Genen

DNA wird von Nuklease an bestimmter Stelle geschnitten

Nach Bruch drei Möglichkeiten:

1. Durch NHEJ werden Basenpaare eingefügt oder deletiert
2. DNA mit Mutation und anschließender homologer Reparatur (zielgerichtete Mutation)
3. DNA mit zusätzl. Abschnitt und anschließender homologer Reparatur (zielgerichtetes Einfügen)

CRISPR/Cas9

Zinkfinger-Nuklease (ZFN)

Transcription-Activator-Like-Effector Nuklease (TALEN)

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

• Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats), die im Erbgut von vielen Bakterien und Archaeen auftreten
• Gehören zum CRISPR/Cas9-System, das Resistenz gegen das Eindringen von fremdem Erbgut durch Viren oder Plasmide vermittelt

ein präzises Instrument, das punktuelle Veränderungen der DNA ermöglicht

Finden, Schneiden, Reparieren

• Cas9 (= Endonuklease) schneidet DNA nachdem Erkennen/Binden spezifischer RNAs (crRNA & tracrRNA) 
• anstatt der beiden cr/tracr RNAs eine Verwendung einer single guide RNA (sgRNA), um Cas9 an eine bestimmte Zielsequenz zu leiten 
• Cas9-Enzym -> Doppelstrangbruch 
• Cas9 mit zwei katalytisch aktive Domänen (RuvC & HNH)

1. durch gezielte Aminosäureaustausche in diesen Domänen wird Cas9 zur Nickase (d.h. nur ein DNA-Strang wird geschnitten)
2. Werden zwei sgRNAs gleichzeitig eingesetzt, können auch staggered nicks in den DNA-Doppelstrang eingeführt werden
3. Inaktiviert man beide Cas9-Domänen (dCas9) kann man das Enzym als RNA-geleitetes DNA-Bindeprotein benutzen, um z.b. die Transkription von Genen gezielt zu inaktivieren oder zu aktivieren 
4. Markiert man das dCas9 (z.B. durch Fluoreszenz), kann man chromosomale Loci für das Live-CellImaging sichtbar machen 
5. Durch Fusion von dCas9 mit DNA-modifizierenden Enzymen ist die gezielte epigenetische Modifikation von Genen möglich

Durch gentechnische Verfahren verändertes Tier 

Trägt ein Fremdgen (mutiertes Gen), das absichtlich in sein Genom stabil eingefügt wurde. 

Das Fremdgen wurde mittels rekombinanter Gentechnologie hergestellt. 

Zusätzlich zum Strukturgen enthält die Fremd-DNA noch Sequenzen, die dazu dienen: 

•  Die Fremd-DNA in das Wirtsgenom zu integrieren
•  Die Fremd-DNA in den Zellen des Wirts zu exprimieren

• Embryonaler Stammzelltechnik
• Pronukleusinjektionstechnik

Aufklärung von 

1. Strukturen, Funktionen und Prozessen in Lebewesen 
2. Beziehung zwischen Lebewesen und ihrer Umwelt 
3. Evolution und genetische Anpassungsprozesse von Lebewesen

...die Deletion oder Inversion von Genen im Organismus