Physiologie tierischer Zellen at Universität Rostock

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Mikroinjektion / zellulare voraussetzungen 

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Ablauf der Mikroinjektion : 

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Was ist die Restlichtmikroskopie (video intensified mikroscopy) 
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Die Mirokapillare 

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Möglichkeiten der Lichtmikroskopie:


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Was versteht man unter dem Auflösungsvermögen? 

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Was für Objektivklassen gibt es? 
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Durchlicht - / Auflichtmikroskopie

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Das Okular : 

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Was versteht man unter Mikroinjektion? 

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Klassische lichtmikroskopie 
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Physiologie tierischer Zellen

Mikroinjektion / zellulare voraussetzungen 
  • Vero- Zellen: 
  • Fibroblastoide Zellen aus der Niere der adulten afrikanischen grünen Meerkatze 
  • Vorgang : 
  • Einen Tag vorher splitten und auf kleine Runde deckgläschen aussäen- deckgläschen mit Glasschreiber markieren 
  • Zellen am Tag der Injektion mikroskopieren - Sie sollten nicht zu dicht gewachsen sein 
  • Deckglas wird in ein petrischale mit frischem Medium überführt und auf den vorgeheizten Objekttisch gestellt 

Physiologie tierischer Zellen

Ablauf der Mikroinjektion : 
  • Kapillare in der Halterung einspannen 
  • Mit dem 40er objektiv, die Zellen fokussieren 
  • Aus der fokusebene herausfahren, bis die Kapillare scharf abgebildet ist 
  • Kapillare mittels Joystick herunterfahren, dabei in der fokusebene folgen, bis die fokusebene der Zelle erreicht ist 
  • Seitlich in das cytoplasma injizieren 
  • Es kommt zum schwallartigen austreten der Infektionsflüssigkeit
  • Höher Druck : Kapillare muss rasch wieder herausgezogen werden 

Physiologie tierischer Zellen

Was ist die Restlichtmikroskopie (video intensified mikroscopy) 
  • Verwendung von Restlichtkameras 
  • Arbeitet iim Bereich, in dem das Auge nicht mehr arbeiten kann (weniger als 10 h. 6 Photonen/ mm2 xS
  • Kann jedes einzelne Photon auffangen 
  • Intensifier bildet fast jede einzelne Photon an der photo Kathode durch einen lichtblitz am leuchtschirm ab 
  • Zählung der Impulse an jeden Pixel nach Detektion durch photonenzählkameras 
  • Dadurch fast keine fluoreszenzfarbstoffe und kaum lichtbestrahlung notwendig 
  • Lange Belichtungszeiten sind notwendig 
  • Einsatz für Biolumineszenz ( luziferase) 

Physiologie tierischer Zellen

Die Mirokapillare 
1)
Bei den kapillaren handelt es sich um um Borsilikatkapillaren mit filament 
Länge : 10 cm
Außendurchmesser: 1,0 mm
Innendurchmesser : 0,78
Mittels eines Kapillarziehgerätes ( Puller) werden Sie fein ausgezogen, so dass eine feine Spitze entsteht, die für unsere versuche empirisch ermittelt wurde 
Das ausziehen erfolgt kurz vor Gebrauch und langes Liegen führt zum verschluss der mikroöffnung 

Physiologie tierischer Zellen

Möglichkeiten der Lichtmikroskopie:


1) Hellfeldmikroskopie ( Sichtbarmachung bis 100 nm )

2) Dunkelfeldmikroskopie (^^ bis 5 nm)

3) Fluoreszenzmikroskopie > 1 nm

Physiologie tierischer Zellen

Was versteht man unter dem Auflösungsvermögen? 
  • Fähigkeit, Strukturen kleiner Objekte unterscheidbar abzubilden 
  • "Auflösung zu vergrößerung" Verhältnis 
  • Angabe über "numerische Apertur" ( Na) 

Physiologie tierischer Zellen

Was für Objektivklassen gibt es? 
  • Achromate 
  • Planachromate 
  • Apochromate 
  • Planpoachromate 
  • Universalobjekte 

Physiologie tierischer Zellen

Durchlicht - / Auflichtmikroskopie
Durchlichtmikroskopie :
-entspricht transillumination 
- Lichtstrahlen durchdringen Objekt von unten oder oben 

Auflichtmikroskopie :
Entspricht Epiillumination 
Lichtstrahlen treffen von oben oder seitlich auf das Objekt, reflektiertes Licht 
Überwiegend bei Metall-, Mineralmikroskopie 

Physiologie tierischer Zellen

Das Okular : 
  • Zweistufen-vergrößerung 
  • Meist 10-fache Vergrößerung 
  • Austrittspupille 
  • Sehfeldzahl 
  • Skala für längenmessung 

Physiologie tierischer Zellen

Was versteht man unter Mikroinjektion? 
Die Mikroinjektion ist das injezieren von gelösten Substanzen unter Druck direkt in die lebenden Zellen 

  • Herkömmliche Verfahren :
  • Fixierung der Zelle, permeabilisierung der Membran
  • AK können Membran passieren und die Zelle markieren 
  • Oder Markierung mit Farbstoffen 

Typische Substanzen, die injiziert werden können :
  • Gereinigte Antikörper 
  • Peptide 
  • DNA, RNA 
  • Rhodamine / phalloidine, Rhodamine/ tubulin u. A. Markierte Substanzen

Physiologie tierischer Zellen

Klassische lichtmikroskopie 
Wird genutzt, um lebende Zellen im Einsatz zu sehen und Bewegungsvorgänge zu beobachten 
Auflösungsvermögen : bis zu 250 nm ( 2000- fache Vergrößerung) 
Auge : 0,2-0,3 nm 

Auflösungsgrenze:
d= 250 nm  halbe Wellenlänge des sichtbaren Lichts, gerade noch mit der lichtmikroskopie auflösbar 
d< 250nm durch Beugung des Lichts entsteht ein vergrößertes Bild, das nicht die echte Größe und Form des submikroskopischen Objekts abbildet. 

AAuflösungsgrenze hängt von der Wellenlänge des benützen Lichtes und von öffnungswinkel von objektiv und Kondensator ab. Bei bester Optik u. U v Licht sind ca. 150 nm zu erreichen 


Physiologie tierischer Zellen

Bleaching of fluorescence in Living cells 
  • Bleichen fluoreszierender Moleküle und Überwachung 
  • Die Erholung vom Bleichen in einer Probe gibt Auskunft über die molekulare Organisation 

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