Gentechnik at Universität Rostock

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Was sind und wozu brauchen wir Vektoren?

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Erläutern Sie das Grundprinzip des Sanger-Coulsen-Verfahrens zur DNA-Sequenzierung & geben Sie die 3 Hauptschritte der Methode an!

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Nach welcher Faustformel berechnet man die Schmelztemperatur eines Oligonucleotids & welcher Anteil der DNA liegt bei dieser Temperatur einzelsträngig vor?

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Was ist eine "EST-Library"? Nennen Sie je einen Vor- & Nachteil gegenüber einer genomischen Bibliothek!

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Enzymreaktion der T4-Ligase + Voraussetzungen des DNA-Moleküls dafür?

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Welche Besonderheiten gibt es beim Arbeiten mit RNA?

Konzentration, Reinheit, RNA bestimmen?

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Welche Enzyme nutzen die Substrate


  • α-32P-dNTPs
  • α -32P-NTPs
  • γ -32P-ATP

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Schmelztemperatur eines Oligonucleotids?

Welcher Anteil der DNA muss ss sein?

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RNA => cDNA

Schritte beschreiben

Warum ist RACE notwendig?

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Umwandlung RNA zu cDNA:

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Wozu braucht man das RACE-Verfahren?
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Vor- & Nachteile von cDNA-Bibliotheken:

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Gentechnik

Was sind und wozu brauchen wir Vektoren?

Als Vektoren bezeichnet man in der Gentechnik replikationsfähige artifizielle DNA-Moleküle, die Fremd-DNA aufnehmen können. Verwendungszwecke sind vielfältig:

  • Klonierung von DNA (molecular cloning); Ziel: Vermehrung von DNA
  • gezielte Veränderung von DNA (zB Mutagenese)
  • Rekombination von DNA-Abschnitten
  • Übertrag von DNA in andere Organismen
  • heterologe Produktion von Proteinen

Gentechnik

Erläutern Sie das Grundprinzip des Sanger-Coulsen-Verfahrens zur DNA-Sequenzierung & geben Sie die 3 Hauptschritte der Methode an!

An einer einzelsträngigen DNA-Matrize wird von einem definierten Starpunkt (Primer) aus der komplementäre Strang durch eine DNA-Pol synthetisiert.

Der Syntheseprozess bricht an jeder möglichen Position durch ddNTPs mindestens einmal ab, wobei das Ende des Abbruchs bekannt ist, sodass die Sequenz rekonstruiert werden kann.


dsDNA 

=> Klonierung des zu sequenzierenden DNA-Moleküls in einen M13-Vektor / in ein pUC-Plasmid (Denaturierung) 

=> enzymatische Synthese des komplementären Stranges von der vorhandenen Matrize durch Einsatz zB des Klenow-Fragments der DNA-Pol I 

=> Erzeugung eines ds-Bereiches, der als Start für die DNA-Pol dient; dies durch Hybridisierung eines kurzen Oligonucleotides (Primer), der als AP für die Synthese des Komplementärstranges dient


  1. Anlagerung eines Primers
    • Synthese des komplementären Stranges durch DNA-Pol
  2. 2. def. Abbruch der Synthese-Reaktion
    • Substrate für die Synthesereaktion => DNA-Pol + dATP, dTTP, dCTP, dGTP
    • Zusatz von ddNTPs führt zum Kettenabbruch, da OH-Gruppe der 3'-Position fehlt, die für das Anheften des nächsten Nucleotids notwendig ist
    • wird zB dATP zugesetzt, erhält man einen Kettenabbruch an allen Stellen, wo sich in der Matrize ein T befindet; es entstehen Populationen von unterschiedlich langen DNA-Strängen, die alle mit ddATP enden
    • um alle 4 Nucleotid-Arten zu erhalten, wird die Synthesereaktion in 4 parallel laufenden Ansätzen durchgeführt
    • es entstehen 4 Populationn neusynthetisierter Oligonucleotide unterschiedlicher Länge, die je mit ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP enden & sich nur um ein Nucleotid in der Länge unterscheiden
  3. gelelektrophoretische Auftrennung der Ansätze
    • Polyacrylamidgele; 0,5 mm dünn
    • enthalten Harnstoff-Denaturierung der DNA
    • Hochspannung & 60°C verhindern Renaturierung
    • jede Bande im Gel entspricht einem DNA-Fragment, das mit dem entsprechenden ddNTP endet & sich von den anderen um ein Nucleotid in der Länge unterscheidet
    • es ist wenig DNA in der Bande enthalten, daher werden die Fragmente mittels Autoradiographie sichtbar gemacht => Zusatz von 35S oder 32P-dATP

Gentechnik

Nach welcher Faustformel berechnet man die Schmelztemperatur eines Oligonucleotids & welcher Anteil der DNA liegt bei dieser Temperatur einzelsträngig vor?

 4x(G+C) + 2x(A+T)


Tm = die Temperatur, bei der 50% der Oligonucleotide einzelsträngig vorliegen.

Gentechnik

Was ist eine "EST-Library"? Nennen Sie je einen Vor- & Nachteil gegenüber einer genomischen Bibliothek!

- Isolation von Poly-A-mRNA

- damit Erststrang-DNA-Synthese

- Sequenzierung des Gemisches 

- viele Sequenzen entstehen (Mio.)

- keine DNA mehr, sondern nur noch Sequenzen werden gesammelt

- 1 Gen hat viele Sequenzen (Zahl abhängig von der Exprimierungsstärke des Gens, je stärker exprimiert, desto mehr Sequenzen dafür da)

- Sequenzen veröffentlicht auf EST-Datenbanken

- ESTs sollten sich überlappen, damit kann man vollständige cDNA-Sequenz per Computer erstellen

- cDNAs am weitesten weg vom 3'-Ende: hören diese alle mit der gleichen Base auf, sollten das Sequenzen sein, die bis zum 5'-Ende reichen


Vorteil: weniger Aufwand

Nachteil: keine vollständige cDNA

Gentechnik

Enzymreaktion der T4-Ligase + Voraussetzungen des DNA-Moleküls dafür?

verbindet Zweitstrang-Fragmente miteinander


Voraussetzungen:

  • Magnesium vorhanden
  • DNA / RNA muss doppelsträngig sein
  • mindestens 5 gepaarte Nucleinbasen müssen da sein

Gentechnik

Welche Besonderheiten gibt es beim Arbeiten mit RNA?

Konzentration, Reinheit, RNA bestimmen?

  • Probleme durch Einzelsträngigkeit: empfindlicher, komplizierte kompakte Isolierung, schneller Turnover, bildet leicht Sekundärstrukturen
  • Konzentration: A260 = 1,0 = 40 µg RNA / mL
    Berechnung photometerabhängig: Verdünnung x 40 x A260 = µg RNA / mL
  • Reinheit: Verhältnis A260/A280
    RNA rein: 1,9 - 2,1

Gentechnik

Welche Enzyme nutzen die Substrate


  • α-32P-dNTPs
  • α -32P-NTPs
  • γ -32P-ATP

?

  • α -32P-dNTPs
    Phosphatase, Klenow-Enzym
  • α -32P-NTPs
    T7-/T3-RNA-Pol
  • γ -32P-ATP
    T4-PNK, T4-DNA-Ligase

Gentechnik

Schmelztemperatur eines Oligonucleotids?

Welcher Anteil der DNA muss ss sein?

Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)

Die Schmelztemperatur ist jene Temperatur, bei der 50% der Oligonucleotide einzelsträngig vorliegen.


Gentechnik

RNA => cDNA

Schritte beschreiben

Warum ist RACE notwendig?

  • Isolierung Gesamt-RNA
  • mRNA-Isolierung
  • cDNA-Synthese
  • cDNA-Vorbereitung
  • Einbau in Vektor


Erststrang

  1. mRNA + Poly-A-Schwanz
  2. + Reverse Transkriptase (DNA-Pol aus RNA-Virus, die ein RNA-Template verwendet)
  3. + dNTPs
  4. RT kopiert die mRNA von 5'=>3'
  5. RNA-DNA-Duplex

Alternativ (wenn kein Poly-A-Schwanz): Gemisch aus 6 bp-Primern; binden randomisiert an die RNA & bilden Duplex

Zweitstrang

  1. RNA entfernen durch Ribonuclease A
  2. + E.coli-DNA-Pol I
  3. Synthese der DNA in Stücken
  4. T4-DNA-Ligase verbindet diese


RACE: wichtig für Promotoranalysen & Genmodelle; 5'- bzw. 3'-Ende bestimmen

Gentechnik

Umwandlung RNA zu cDNA:

Erststrangsynthese

1. Poly-A-Schwanz

2. Reverse Transkriptase => DNA-Pol, die ein RNA-Template verwendet (stammt aus RNA-Virus)

3. dNTPs dazu

4. Reverse Transkriptase macht Kopie der mRNA von 5'-3'

5. RNA-DNA-Hybrid-Duplex


ohne Poly-A: random hexamer primer

1. Gemisch aus Primern, die 6 Basen lang sind

2. können irgendwo an jede RNA binden


Zweitstrang-Synthese

1. RNA entfernen: RNAse Ribonuclease A (= Endonuclease, schneidet im vorhandenen mRNA-Strang)

2. E. coli DNA-Pol I (Proofreading, Nuclease)

3. Synthese DNA in Stücken

4. T4-DNA-Ligase verbindet

Gentechnik

Wozu braucht man das RACE-Verfahren?
  • Vervollständigen von cDNA
  • Promotor- & Terminatoranalysen
  • Bestimmung von 5'- & 3'-Enden

Gentechnik

Vor- & Nachteile von cDNA-Bibliotheken:
  • Vorteile
    • nur codierende Sequenzen enthalten
    • Gewebe-, Zeitspezifität
    • kann direkt in Bakterien exprimiert werden
  • Nachteile
    • nie vollständig => seltene RNAs fehlen
    • cDNAs sind meist unvollständig
    • aufwändig

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